2023-03-10 18:15
作者 韩韦华
京港感染论坛
多学科合作，构建诊断管理体系
包埋在细胞外聚合物基质中的固着微生物群落是生物膜的组成成分之一。细菌为了抵抗外界对其生长的不利条件，主要以生物膜的形式存在。与浮游细菌相比，生物膜保护细菌抵御化学性刺激、生理应激、剪切力、抗菌药物等的清除，使得生物膜相关的感染难以治疗。形成生物膜的复杂群落通常包含相互作用的不同物种，这些物种间的相互作用可分为共生、拮抗和协同，并随着微环境（如pH、温度、氧气、营养和代谢物水平等）和群体感应信号的改变动态演变。粪肠球菌和金黄色葡萄球菌都是引起医院获得性感染的机会致病菌，虽然经常在生物膜相关感染患者中共分离，如心内膜炎、尿路感染、糖尿病足等，但是它们在生物膜中的相互作用还未被阐明。
新加坡南洋理工大学的Kimberly A. Kline教授课题组一项研究发现粪肠球菌和金黄色葡萄球菌通过血红素相互给食在生物膜形成中存在种间相互作用，可以解释粪肠球菌和金黄色葡萄球菌在生物膜相关感染中共存的现象。
该研究发表于《The ISME Journal》（JCR分区Q1区，中科院SCI期刊分区1区，2022年影响因子11.217），标题为《Heme cross-feeding can augment Staphylococcus aureus and Enterococcus faecalis dual species biofilms》，新加坡国立大学的Jun-Hong Ch’ng为该论文的第一作者，新加坡南洋理工大学的Kimberly A. Kline教授为该论文的通讯作者。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41396-022-01248-1
由于粪肠球菌和金黄色葡萄球菌经常共分离自生物膜相关感染，作者首先通过聚苯乙烯微量滴定法结合结晶紫染色方法以探究双菌株共培养是否能够增加生物膜中的生物量。研究发现，与粪肠球菌OG1RF菌株（分离自人口腔，具有利福平和夫西地酸抗性）和金黄色葡萄球菌USA300LAC菌株单独培养相比，两者以1:1混合培养时从培养的第1天起生物膜形成就明显增强，且在培养的第4天达峰值（图1A）。基于单菌株培养和双菌株培养生物膜形成的最大差异出现在第5天，所以作者选择培养第5天进行后续实验。
为确定双菌株共培养增加的生物量是否基于细菌数量的增加，作者对第5天形成的生物膜进行菌落计数。与OG1RF单菌株培养相比，双菌株培养中粪肠球菌数量增加5倍，与生物膜结果一致（图1B），说明金黄色葡萄球菌能够促进粪肠球菌在生物膜中的生长。作者并未发现浮游细菌共培养时能够增加粪肠球菌数量，说明金黄色葡萄球菌促进粪肠球菌生长具有生物膜特异性（图1C）。
▲图1.单菌株和双菌株共培养生物膜形成和菌落计数
为研究金黄色葡萄球菌促进粪肠球菌生物膜形成是否是最初研究中所使用的菌株（粪肠球菌OG1RF菌株和金黄色葡萄球菌USA300LAC菌株）所特有的现象，作者选择15株金黄色葡萄球菌（包括5株实验室研究常用菌株和10株临床菌株）与粪肠球菌OG1RF菌株共培养，结果发现Newman和C37菌株不能促进生物膜中生物量的积累，可能是由于Newman和C37菌株具有抗肠球菌活性和生物膜限制性（图2A）。32株粪肠球菌菌株（包括3株实验室研究常用菌株和28株临床菌株）与金黄色葡萄球菌USA300LAC菌株共培养后仅6株能够增强生物膜形成（图2B），说明双菌株共培养促进生物膜形成存在菌株特异性。
▲图2.粪肠球菌和金黄色葡萄球菌共培养后生物膜形成能力改变
为研究金黄色葡萄球菌促进粪肠球菌在生物膜中生长的分子机制，作者通过筛选粪肠球菌转座子突变文库发现存在7个基因的9个突变体响应USA300LAC菌株刺激促进生物膜形成的能力减弱，其中USA300LAC菌株无法增强OG1RF菌株的3个menA转座子突变体和1个cydA转座子突变体生物膜形成（图3A），表明menA和cydA是双菌株共培养促进生物膜形成的关键因子，这两个基因都编码参与有氧呼吸的蛋白质，这促使作者对此进行更深入的研究。
▲图3A. 亲本菌株（OG1RF）和9个转座子突变体单独培养和与金黄色葡萄球菌（USA300LAC）共培养5天后的生物膜形成水平 图3B.粪肠球菌有氧呼吸需要MenA、CydA、CydB、血红素和O2
与OG1RF菌株单独培养相比，有氧条件下金黄色葡萄球菌能够显著增强粪肠球菌生物膜形成，而这一现象在无氧条件下没有观察到，进一步说明USA300LAC菌株增强OG1RF菌株生物膜形成需要O2（图4）。
粪肠球菌利用O2依赖细胞色素bd复合物，后者需要外源性血红素作为辅因子（粪肠球菌无法合成血红素）。研究发现，添加血红素和血红蛋白后亦能增强OG1RF菌株在有氧条件下的生物膜形成能力（图4B），并伴随O2消耗速率加快。细胞色素bd复合物由cydA、cydB编码的两个亚基和三种细胞色素b558、b595、d组成；cydC和cydD编码功能性细胞色素bd复合物表达所需ATP-结合盒（ABC）型转运蛋白。研究发现cydA、cydB、cydC、cydD转座子突变以及cydB、cydD缺失突变均减弱金黄色葡萄球菌和血红素对粪肠球菌的生物膜增强响应，且cydB、cydD回复突变后均能恢复该现象，表明功能性cydABCD操纵子是粪肠球菌有氧呼吸所需的（图5A）。menA编码1，4-二羟基-2-萘甲酸异戊烯基转移酶，将1，4-二羟基-2-萘甲酸酯转化为去甲基甲萘醌。menA转座子突变也减弱金黄色葡萄球菌和血红素对粪肠球菌的生物膜增强响应，表明粪肠球菌有氧呼吸需要去甲基甲萘醌的参与（图5A）。
为研究细胞色素bd（CydAB）和ABC转运蛋白（CydDC）在粪肠球菌生物膜增强响应中的具体功能，通过液相色谱-质谱联用仪测量细菌细胞内血红素含量。发现无法检测到cydA、cydB、cydC、cydD转座子突变体以及cydB、cydD缺失突变体细胞内血红素含量，且仅cydD回复突变菌株能部分恢复细胞内血红素水平，而cydB回复突变菌株细胞内血红素水平无改变（图5B），说明cydDC操纵子编码产物具有将血红素转运至细胞内的功能。
▲图4.在无氧（A）和有氧（B）条件下粪肠球菌的生物膜增强响应
▲图5. 亲本菌株（OG1RF）、cydABCD转座子突变体、cydB、cydD缺失突变体及回补菌株与血红素和金黄色葡萄球菌（USA300LAC）共培养后的生物膜形成水平（A）和细胞内血红素含量（B）
已证明与金葡菌共培养或添加血红素能够促进粪肠球菌生物膜形成，作者猜想增强生物膜形成的血红素是否由金黄色葡萄球菌合成和释放。金葡菌四个核心血红素生物合成酶基因（hemA、hemB、hemE、hemL）转座子突变体中，仅hemB突变会导致金葡菌生长缺陷、血红素合成显著降低。与野生菌株USA300LAC相比，hemB转座子突变体无法促进粪肠球菌生物膜合成（图6），表明金黄色葡萄球菌通过合成血红素增强粪肠球菌生物膜形成能力。
自溶素AtlA在金黄色葡萄球菌形成生物膜的自溶阶段发挥重要作用，作者猜想自溶是否与金黄色葡萄球菌释放血红素、促进生物膜形成有关。与USA300LAC相比，atlA转座子突变体促进粪肠球菌生物膜形成的能力部分减弱（图6），表明自溶素AtlA有助于金黄色葡萄球菌释放血红素，但不是必需的。
▲图6.血红素合成缺陷和自溶缺陷金黄色葡萄球菌减弱促进粪肠球菌生物膜形成的能力
作者发现USA300LAC无法增强缺乏明胶酶活性的OG1X粪肠球菌菌株生物膜形成，猜想编码明胶酶的gelE基因是否与利用USA300LAC来源的血红素有关。构建OG1X△gelE菌株，OG1X△gelE仅在游离血红素存在时能够增强生物膜形成；而血红蛋白和USA300LAC（结合形式血红素）均不能促进OG1X△gelE菌株生物膜形成（图7），说明粪肠球菌明胶酶GelE在利用金葡菌来源的结合形式血红素时发挥血红蛋白水解活性。
▲图7.gelE基因缺失对血红素利用的影响
总之，该研究证明了金黄色葡萄球菌合成的血红素通过激活粪肠球菌有氧呼吸，能够增强粪肠球菌生物膜形成。在大多数情况下，分泌性血红蛋白在菌株间的相互给食需要借助粪肠球菌的明胶酶的血红蛋白水解活性。本项研究强调了生物膜中种间相互作用的重要性，并强调了识别潜在的决定因素（如血红素）的重要性，有利于开发在复杂宿主环境中干预细菌生长的措施。
韩韦华
同济大学2022级临床检验诊断学硕士，主要研究方向为病原微生物的耐药、致病机制及分子流行病学。
END
摘译｜韩韦华 （上海市肺科医院）
审校｜余方友 （上海市肺科医院）