2023-05-04 16:24
作者 石俊红
京港感染论坛
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细菌在获得对抗生素的耐药性之前就获得了耐受性，与抗生素耐药性的表型不同，抗生素耐受性的表型与特定的基因突变无关。许多研究表明细菌的代谢状态影响其对抗生素的敏感性，然而代谢状态如何影响从耐受性到耐药性的转变的机制尚不清楚。
中山大学生命科学学院彭博教授课题组一项研究发现氨苄西林控制的葡萄糖代谢操纵着细菌从耐受性到耐药性的转变，该研究发表在《Science Advances》（JCR分区Q1，2023年影响因子14.957），标题为《Ampicillin-controlled glucose metabolism manipulates the transition from tolerance to resistance in bacteria》。
原文链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9995076/
▼ 一、抗生素耐受性和耐药性相关代谢谱的特征
将大肠杆菌K12每天间歇性暴露于含有或不含氨苄西林（AMP；100 μg/ml）的培养基中，持续10天（每天一个周期；100 μg/ml 持续4.5h，0.625 μg/ml 持续16h）。生长曲线和牛津杯法抑菌试验结果显示，前6个周期中，与未暴露组相比，暴露于AMP组的K12生长更慢，但两组的抑菌区域无差异；在后4个周期中，两组的生长速度相同，而暴露于AMP组的抑菌区域逐渐减少，这表明K12在前6个周期中获得了对AMP的耐受性(T)，第7个周期是一个转折点(S)，在后4个周期获得了对AMP的耐药性(R)。
气相色谱-质谱（GCMS）分析显示随着周期的增加，葡萄糖的丰度减少，对LB培养基中的葡萄糖定量结果一致，而KEGG通路分析显示受影响最大的通路是三羧酸循环，这提示葡萄糖的代谢（包括葡萄糖的转运和分解代谢）可能参与了细菌对AMP从耐受性向耐药性的转变。
▼ 二、氨苄西林对葡萄糖代谢的调节是从耐受性向耐药性转变的关键
葡萄糖转运依赖于糖磷酸转移酶系统（PTS），相关基因包括ptsI、ptsH、crr和ptsG。暴露于AMP组的4个基因表达情况与葡萄糖丰度的动态变化相似：在耐受组细菌中表达较高，在转折点处相同，在耐药组细菌中表达较低，而且ptsI、ptsH、crr的表达水平以AMP剂量依赖的方式升高，添加4mM葡萄糖后，结果一致，而且耐药性的出现延迟到第12周期。pts启动子DNA结合AMP实验结果显示，AMP结合水平以pts启动子DNA浓度依赖的方式升高，且只有当pts的P1b位点发生突变时，AMP结合水平下降，这在抗生素杀菌试验和小鼠感染模型中进一步得到验证。与野生菌株相比，∆crr、∆ptsH菌株以及pts启动子缺失的突变体使耐药性提前到第5周期。
▼ 三、PDH活性降低的机制
葡萄糖分解代谢生成的葡萄糖-6-磷酸，可以进入糖酵解途径，接着代谢通量进入丙酮酸循环（可以为细菌提供呼吸能量）。定量分析发现暴露于AMP组的相关基因的表达以及酶的活性与葡萄糖丰度的动态变化完全不同：在转折点前逐渐增加，转折点后逐渐下降，在最后一个周期中低于未处理的对照组，其中aceE表达和其编码的丙酮酸脱氢酶（PDH）活性的变化最为显著。抑菌试验结果显示AMP可以结合aceE继而抑制PDH活性，但微尺度热电泳提示因此而积累的丙酮酸会与AMP竞争结合aceE然后激活PDH，消耗葡萄糖，并导致这些耐受周期中葡萄糖逐渐减少。
▼ 四、葡萄糖代谢的变化与较高的ROS丰度相关
葡萄糖-6-磷酸的去路还包括与ROS释放增加有关的磷酸戊糖途径。定量分析发现暴露于AMP组的相关基因及酶的活性情况与葡萄糖丰度的动态变化相似。生长曲线和抑菌试验结果显示∆aceE菌株使耐药性推迟到第16周期，其ROS丰度也在第16个周期才达到峰值，这表明糖酵解中断会导致葡萄糖代谢流驱动磷酸戊糖途径，从而产生更多的ROS。Mn2+/硫脲和H2O2/Fe 3+分别能够清除和产生ROS。Mn2+/硫脲和AMP的协同作用推迟了ROS的升高和耐受性向耐药性的转换，H2O2/Fe 3+处理后结果相反，这提示ROS丰度有助于耐受性的发生和耐药性的转换。
▼ 五、降低的葡萄糖激活cAMP/CRP复合物的表达和耐药性
以往报道P1b是环腺苷酸受体蛋白（cAMP receptor protein，CRP）的结合位点，微尺度热电泳结果显示AMP可以抑制CRP与P1b启动子的结合。文献报道葡萄糖可以负向调控cAMP/CRP复合物的表达和活性，而前期实验中观察到低水平的葡萄糖，作者进一步证明了随着对AMP耐药性的增加和葡萄糖浓度的降低，cAMP水平、CRP mRNA的表达增加，提示cAMP/CRP的表达可以被葡萄糖水平的降低所激活，从而促进耐受性向耐药性的转变。生长曲线和抑菌试验结果显示∆crp细菌使耐药性推迟到第12/13周期。对葡萄糖的转运和分解代谢相关基因定量发现cAMP/CRP抑制葡萄糖转运、糖酵解和磷酸戊糖途径，减少ROS的产生。
▼ 六、cAMP/CRP正向调节DNA修复，促进对AMP耐药性的获得
DNA错配修复不足，会增加DNA损伤导致对抗生素耐药性突变的可能性。与野生菌株相比，DNA错配修相关基因在∆crp细菌组表达减少，提示cAMP/CRP正向调控DNA错配修复。有研究表明cAMP/CRP可以间接调控ampC，定量分析发现∆crp细菌组的ampC的表达减少，暴露于AMP导致ampC的表达增加，AmpC的活性测定显示抑菌区随着时间周期的增加而减少，说明耐药性增加，这些结果表明cAMP/CRP通过诱导ampC促进抗生素耐受性向抗生素耐药性的转变。
总之，作者发现葡萄糖是决定氨苄西林耐受和耐药大肠杆菌和晚迟缓爱德华氏菌的关键代谢物。作者证明氨苄西林靶向pts启动子来促进葡萄糖转运并抑制丙酮酸脱氢酶（PDH），从而使葡萄糖通量到磷酸戊糖途径而不是糖酵解，但因此积累的丙酮酸会与AMP竞争激活PDH，消耗葡萄糖，并且在耐受性时达到平台期。当葡萄糖逐渐低于正常水平时，cAMP/CRP系统被激活，激活的cAMP/CRP可以正向调节DNA修复，负向调控葡萄糖转运和ROS的产生，以触发氨苄西林耐药性。胞内细菌迟缓爱德华氏菌也出现上述类似的结果，这表明胞外和胞内细菌含有相同的AMP-pts/PDH-葡萄糖-cAMP/CRP-ROS调控级联反应，介导了氨苄西林耐受性向耐药性的转变。这些发现提示葡萄糖代谢是一个很有希望的延迟或阻断抗生素耐受性向耐药性转变的靶点。
石俊红
同济大学2022级临床检验诊断学博士生，主要研究方向为病原微生物的耐药、致病机制及分子流行病学。
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作者｜石俊红（上海市肺科医院）
审校｜余方友（上海市肺科医院）