烟曲霉是引起临床真菌感染最主要也是最重要的菌种之一，研究者以探寻能增强卡泊芬净（CAS）对烟曲霉抗真菌效果的化合物为切入点，采用最小有效浓度法从4个化学药物库中进行筛选，发现了5个CAS增强剂（即20 µM能够部分抑制真菌生长，当与CAS联用时抑制作用增强的化合物），分别是chlormidazole、ravuconazole、5-fluorocytosin、ciclopirox和MMV1593544；此外，还发现了12个增效剂（即20 µM不能抑制真菌生长，但与CAS联用时抑制作用增强的化合物)，其中包括BRI。

宿主防御肽模拟物BRI是一种模拟宿主防御蛋白两亲性结构的小分子化合物，正被研究用于治疗革兰氏阳性菌引起的急性皮肤感染，也被报道其具有一定的抗病毒效果（如SARS-Cov-2）。多次临床试验显示BRI有良好的治疗效果和安全性。但对于BRI的抗真菌效果或协同增效作用研究较少。综上，研究者选定BRI进一步研究。

药物敏感实验表明，BRI单独使用时MIC值大于80 µM，但20 µM的BRI联用CAS（0.2或0.5 μg/mL）或伏立康唑（VOR，0.125或0.25 μg/mL）时，在37℃作用48小时能完全抑制烟曲霉分生孢子的萌发，这种抑制作用具有持续性。BRI 和CAS是被动地通过细胞膜运输，不需要ATP。此外，CAS 联用 BRI可使棘白霉素耐药的烟曲霉临床分离株的细胞膜去极化，减少其生物膜形成，并可完全或部分克服其对CAS的耐药。

▲图1. BRI是CAS的协同增效剂

为了探讨BRI可能影响到烟曲霉哪些信号通路，揭示其协同增效CAS抗真菌作用的机理，研究者通过添加蛋白激酶抑制剂来观察BRI对烟曲霉生长和代谢活性的影响。

研究发现，两个Sterile-20激酶超家族成员（p21活化激酶和STK25）抑制剂的添加能增强BRI对烟曲霉的抗真菌效果。p21活化激酶（PKAs）通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路参与信号传导；而与STK25最接近的同源物是酿酒酵母中CAMP介导的信号蛋白Sok1p，Sok1p过表达抑制了蛋白激酶A活性缺失突变体的生长缺陷。基于此，研究者进一步检测了BRI对四个烟曲霉MAPK通路相关的缺失突变株（ΔsakA、ΔmpkC、Δmpk和ΔmpkA）的生长抑制作用，发现只有ΔmpkA突变株对BRI更敏感，代谢活性显著降低，且存在严重的生长缺陷。

▲图2. MAPK MpkA和钙调磷酸酶calA

此外，作者还探讨了BRI分别对单个磷酸酶催化亚基缺失突变株生长的影响，发现ΔcalA突变株（编码钙调磷酸酶催化亚基）对BRI的敏感性增加，存在严重的生长缺陷，并且环孢霉素（CsA，钙调磷酸酶特异性抑制剂）与BRI存在协同作用，提示BRI可能影响了烟曲霉钙调磷酸酶信号通路（钙调神经磷酸酶通路在烟曲霉的渗透胁迫信号响应和维持细胞壁完整性中具有重要作用，在真菌耐药性的产生中也发挥了重要作用）。ΔmpkA和ΔcalA缺失突变株在药物敏感性、细胞壁几丁质基因表达和含量等方面存在差异。蛋白激酶C（PKC）对烟曲霉细胞壁完整性（CWI）通路的激活很重要，而结果显示，PKC抑制剂如chelerythrine和calphostin C也与BRI具有协同作用。

总之，以上数据表明BRI影响了烟曲霉的钙调磷酸酶信号通路和细胞壁完整性相关通路，是其可能的CAS协同增效机制。

▲图3. BRI通过影响烟曲霉细胞壁完整性通路在烟曲霉中起作用

接下来，研究者对BRI是否能增强CAS对其他病原真菌（如新型隐球菌、白色念珠菌和耳念珠菌）的抗真菌效果进行了探讨。作者首先测定了BRI 单独使用时对新型隐球菌、白念珠菌和耳念珠菌的MIC值，结果分别为2.5 µM、80 µM和80 µM；接下来测定了CAS单独使用时对新型隐球菌的抗真菌效果，结果发现CAS抗新型隐球菌效果不甚理想，只有较高的浓度（32 µg/mL）才能完全抑制新型隐球菌的代谢活性（XTT法），16µg/mL浓度的CAS 可使存活率（CFU法）降低约50%；最后研究者检测了BRI联用CAS时对新型隐球菌的MIC值，发现仅0.625 µM的BRI就可增强 CAS 的抗真菌效果（完全抑制新型隐球菌的代谢活性和生长），并且CAS的MIC值亦减少（0.25 ~ 0.5 µg/ml）。同样地，BRI可增强CAS对白色念珠菌和耳念珠菌的抗真菌效果。这部分结果表明BRI作为CAS增效剂可以应用于治疗不同人类真菌病原体引起感染的可能。

▲图4. BRI增强CAS对其他真菌的抗真菌作用

泊沙康唑（POSA）可用于毛霉菌病患者脂质体两性霉素B（LAMB）治疗的序贯方案，或LAMB不耐受患者的替代方案，因而研究者对BRI是否能增强POSA对毛霉菌（ 包括戴尔根霉、米根霉、伞状毛霉菌和卷枝毛霉）的抗真菌作用进行了探讨。结果显示，BRI 可增强POSA对毛霉菌的体外活性。

▲表1. BRI增强POSA对毛霉菌的抗真菌作用

研究者在A549细胞系上评估了BRI的细胞毒性，结果显示BRI单用（40或80 µM）或联用CAS均未观察到明显的细胞毒性，并且“细胞-烟曲霉共培养杀灭实验”显示联用BRI 增强了CAS对烟曲霉的杀灭效果。

▲图5. 人体细胞毒性实验和肺曲霉病化疗小鼠模型

最后，研究者在肺曲霉病（IPA）化疗小鼠模型和真菌角膜炎（FK）小鼠模型中进行了体内实验。对于IPA化疗小鼠模型（如图5），与对照组相比，BRI 联用CAS治疗可显著降低小鼠肺部菌量约 95%（感染3天后），而单用CAS （1 mg/kg）或BRI （50 mg/kg） 治疗的小鼠肺部菌量降低了约50%，这提示BRI联用CAS能够清除IPA化疗小鼠模型中烟曲霉肺部感染。

为了确定BRI在不同的疾病背景下是否具有临床应用价值，研究者在FK小鼠模型中进行了研究，结果显示BRI抑制了角膜内的真菌增殖，减小了病理损伤，并且对眼表无毒（如图6）。

▲图6. 真菌角膜炎小鼠模型

由于可用抗真菌药物的数量减少和耐药性的出现增加，迫切需要新的抗真菌药物。处于临床开发不同阶段的新型潜在抗真菌药物很少，新药的研发由于种种条件的限制往往需要很长的时间。

对于抗真菌策略的研究，另一可行的思路是基于现有药物探索新的应用潜能，比如探寻药物增强剂。该研究以探寻能增强CAS对烟曲霉抗真菌效果的化合物为切入点，成功筛选得到了CAS增效剂BRI，研究者还进一步揭示了BRI可能影响烟曲霉的钙调磷酸酶信号通路和细胞壁完整性来发挥了对CAS的协同增效作用的机制，并在“BRI联用CAS对其他病原真菌的效果”和“BRI联用其他抗真菌药物（如唑类）”两方面进行了拓展和延伸，最后在细胞毒性、动物感染模型中探讨了BRI的临床应用价值。

总的说来，该研究对BRI的协同增强作用进行了较为完善的研究，为抗真菌诊疗策略的探究提供了新的思路，也为抗真菌药物的研发提供了理论依据。

作者｜邓稀仁（四川省医学科学院·四川省人民医院）

审校｜余方友（上海市肺科医院）