2023-05-19 17:20
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京港感染论坛
多学科合作，构建诊断管理体系
该研究建立了适用于从尿液中检测病原体及耐药基因的实验流程及生信分析方法，并收集来自多中心的1045例样本进行性能验证。结果表明，纳米孔宏基因组技术可以快速、准确地检测出尿路感染病原体和耐药基因。值得注意的是，自主研发的生物信息学流程可以在尿液中高灵敏度地检测出耐药基因，从而使临床医生能够及时准确地调整抗菌药物处方决策。
近日，上海市东方医院吴文娟教授团队和先声诊断科研及感染生信团队合作，联合上海市儿童医学中心，复旦大学附属华东医院，北京大学第一医院开展多中心临床研究，在Clinical and Translational Medicine 杂志发表最新的研究成果：Detection of pathogens and antimicrobial resistance genes directly from urine samples in patients suspected of urinary tract infection by metagenomics nanopore sequencing: A large-scale multi-centre study。
尿路感染（UTI）是一种常见的感染性疾病，而传统的检测方法需要进行微生物培养和药敏试验，耗时且成本高。以往使用基因组学纳米孔测序技术检测尿路感染（UTI）病原体和/或抗菌药物耐药（AMR）基因的研究样本数量较小，且仅关注由细菌引起的UTI。
该项研究在已发表流程的基础上调整皂苷的使用量和PCR系统，开发了新的实验操作流程。确定了大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，白色念珠菌三种常见UTI病原体的检测下限（LoDs），同时精密度结果证实了方法的稳定性和重复性。
为了准确检测病原体，该研究提出了一个多步骤的工作流程，使用blast cutoff、第二最佳匹配reads比率、最少reads数和RPK（reads per thousand sequence reads）等参数过滤假阳性结果。首先使用来自上海东方医院的845个样本评估该方法的检测性能。该研究使用了两个参考标准判断病原体检测结果准确性：（1）临床微生物培养金标准；（2）包括临床微生物培养和qPCR结果的复合标准。随机将样本分成训练集（n = 199个样本）和验证集（n = 646个样本）。选择不同的RPK阈值绘制ROC曲线，并获得尤登指数最大的RPK阈值。随后，在验证集中计算灵敏度和特异性。在验证集中，仅使用临床微生物培养标准，细菌和真菌检测的灵敏度分别为89.8％和96.3％；特异性分别为76.9％和90.1％。使用临床微生物培养与qPCR的复合标准，细菌和真菌检测的灵敏度分别为98.4％和98.2％；特异性分别为85.4％和98.1％。
该研究使用823个具有明确临床诊断信息的样本（758个UTI和65个non-UTI）进行诊断性能评估。与尿液培养相比，纳米孔测序在UTI诊断方面表现了更高的灵敏度（87.86％ vs. 81.66％，P<0.01），特异性有所降低。然而在10个纳米孔测序假阳性样本中，有6个样本存在潜在感染可能，因为它们都来自具有UTI风险因素的患者。在90个纳米孔测序假阴性样本中，有80个样本呈微弱阳性（检测到病原体读数，但未达到阈值）。此外，纳米孔测序检测到的混合性UTI（有两种或更多病原体）频率要比尿液培养高得多（33.51％ vs. 5.81％，P<0.01）。
▲图 1. 纳米孔测序的病原体检测和UTI诊断性能
接下来，研究验证了在北京大学第一医院, 复旦大学附属华东医院，上海儿童医学中心3家医院纳米孔测序的病原体检测性能。使用复合标准，在细菌检测中，灵敏度分别为98.9％、97.6％和95.4％；特异度分别为68.3％、79.7％和76.3％；在真菌检测中，灵敏度分别为100％、100％和85.7％；特异度分别为96.7％、98.4％和97.4％。
▲图 2.在三家医院中对宏基因组纳米孔测序的检测性能验证结果
在病原体水平，纳米孔测序提高了常见UTI病原体，如大肠埃希菌、肠球菌和白色念珠菌的检出率。同时，纳米孔测序检出了UTI感染中难以培养或罕见的病原体，如海氏肠球菌和肠道沙门氏菌等。四个中心检出率较高的病原体基本一致，与之前的研究结果也一致。
▲图 3.纳米孔测序和尿液培养在病原体水平的比较
为了准确检出抗菌药物耐药（AMR）基因，研究开发了NanoAMR流程。在使用模拟数据验证了流程性能后，重点检测了大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中碳青霉烯耐药和ESBL阳性表型相关的基因。在培养结果为大肠埃希菌的样本，表现为碳青霉烯耐药表型的3个尿样中，纳米孔测序在2个样本中检测到了blaNDM基因；表现为ESBL阳性的43个尿样中，纳米孔测序在37个样本中检测到blaCTX-M基因，其中最常见的是blaCTX-M-14。在培养结果为肺炎克雷伯菌的样本中，6个表现为碳青霉烯耐药且产丝氨酸酶的尿样中都检测到blaKPC基因，在1个表现为碳青霉烯耐药且产金属酶的尿样中检测到blaNDM-5基因；表现为ESBL阳性的5个尿样中均检测到blaSHV或blaCTX-M基因。这些结果表明，纳米孔测序可以高灵敏度地检测大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌碳青霉烯耐药和ESBL阳性菌的相应耐药基因，特别是对肺炎克雷伯菌耐药基因的检测，12个样本的灵敏度达到了100％。
▲图 4.大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中与碳青霉烯类耐药性和ESBL阳性表型相关的内酰胺酶基因的检测
实验结果表明，该研究建立的通过纳米孔宏基因组技术检测尿液样本中病原体及耐药基因的实验流程及生信分析方法，可以快速、准确地检测出尿路感染病原体和耐药基因，从而使临床医生能够及时准确地调整抗菌治疗方案。
杨思敏
同济大学附属上海市东方医院，主治医师，导师为吴文娟教授，主要研究方向为病原微生物的耐药及分子流行病学。
通信作者：吴文娟
博士、同济大学教授、博士生导师，同济大学附属东方医院南院检验科主任。中国女医师协会五洲女子科技奖获得者、国家卫生健康委药敏标准委员会专家、中国合格评定委员会主任评审员、全国卫生系统新冠肺炎疫情防控先进个人、上海市公共卫生三年行动计划重点学科负责人、上海市卫健委优秀学科带头人、上海市科委学术技术带头人。
研究方向：病原微生物快速检测及耐药机制研究、医院感染控制等。主持国家科技重大专项课题2项、国家自然科学基金4项、省市级课题和人才计划20余项，发表论文140余篇，编写行业标准、专著10余项，申请发明专利8项。
END
作者｜杨思敏（同济大学附属上海市东方医院）
审校｜余方友（上海市肺科医院）