2023-06-06 17:20
作者 戴媛媛、常文娇
京港感染论坛
多学科合作，构建诊断管理体系
金黄色葡萄球菌是临床常见的致病菌，可引起多种严重感染，严重威胁人类健康和生命安全。金黄色葡萄球菌极易产生耐药性，万古霉素被认为是临床上治疗严重金黄色葡萄球菌感染的最后一道防线。尽管完全耐万古霉素的金黄色葡萄球菌并不常见，但是万古霉素中度耐药的金黄色葡萄球菌（VISA）和异质性万古霉素中介的金黄色葡萄球菌（hVISA）被频繁检出，为临床治疗带来巨大挑战。S-亚硝基化是一种由一氧化氮（NO）介导的巯基半胱氨酸的翻译后修饰，在真核细胞中介导氧化还原的信号转导功能，但其在细菌中的作用尚不清楚。
中国科学技术大学生医部的孙宝林教授课题组和首都医科大学附属北京儿童医院的于丹副教授课题组合作的一项研究发现金黄色葡萄球菌NO合成酶（NOS）催化生成的NO通过介导转录因子MgrA或WaIR发生S-亚硝基化修饰，促进转录因子对自溶相关靶基因的负调控效应，导致细菌自溶活性下降，细胞壁增厚，进而促进金黄色葡萄球菌对万古霉素的耐药。
该研究发表于《Nature Communications》（JCR分区Q1区，中科院SCI期刊分区1区，2022年影响因子17.694），标题为《Transcription tuned by S-nitrosylation underlies a mechanism for Staphylococcus aureus to circumvent vancomycin killing》，中国科学技术大学的舒雪琴博士为该论文的第一作者，中国科学技术大学的孙宝林教授和首都医科大学附属北京儿童医院的于丹副教授为该论文的通讯作者。
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37085493/
▼ 1.内源NO介导金黄色葡萄球菌MgrA S-亚硝基化修饰
作者用液相色谱-质谱(LC-MS)/MS和蛋白组学对临床分离的一株VISA菌株（XN108）进行了S-亚硝基化修饰组学分析发现，这株菌共有302个蛋白（约占总蛋白的10.1%）的484个半胱氨酸位点发生了S-亚硝基化修饰（Fig 1a）。这些S-亚硝基化修饰蛋白涉及VISA生命活动的各个通路，说明蛋白发生S-亚硝基化修饰是VISA生长的显著特征之一。作者还在此VISA菌株中发现8.9%的发生S-亚硝基化修饰的蛋白参与转录过程，如MgrA, WalR, SarR, SarS和ArcR（Fig 1b），表明VISA中存在一个由S-亚硝基化修饰驱动的转录调控网络来平衡亚硝化胁迫。因此作者将研究聚焦与抗生素抗性具有重要关联的转录调控因子MgrA上，发现其第12位的半胱氨酸残基发生了S-亚硝基化修饰（Fig 1c，d）。该残基位于MarR型螺旋-转角-螺旋(HTH) DNA结合域内，位于蛋白质二聚体的界面上（Fig 1e）。为了验证蛋白组学的结果，作者通过western blot对MgrA由NO介导的S-亚硝基化修饰进行了验证（Fig 1f）。
▲图1. 内源NO介导MgrA的S-亚硝基化修饰
▼ 2.NO介导的MgrA S-亚硝基化修饰促进金黄色葡萄球菌对万古霉素的耐药性
为了研究MgrA的S-亚硝基化是否影响VISA对万古霉素的耐药性，作者通过等位基因替换，将12位半胱氨酸点突变为不能被修饰的丝氨酸构建了MgrA C12S点突变菌株。发现MgrA C12S突变株与NOS敲除菌株类似，均表现出万古霉素MIC显著下降（Fig 2a，2b）。作者随后添加了外源性的NOS抑制剂——NG-硝基精氨酸甲酯（L-NAME），发现细菌在含万古霉素的培养基中生长速度减缓（Fig 2c，2d），表明NO可以调节金黄色葡萄球菌对万古霉素的耐药性。
▲图2 NO介导的MgrA S-亚硝基化修饰促进VISA菌株对万古霉素的耐药性
▼ 3.MgrA S-亚硝基化以NO-依赖的方式促进金黄色葡萄球菌对万古霉素耐药
作者进一步研究了添加NO是否可以恢复Δnos或MgrA C12S在含万古霉素的培养基中的生长。在含2 µg/ml万古霉素的培养基中添加低浓度的外源性NO供体（硝普钠，SNP）后可恢复Δnos菌株在万古霉素环境中的生长速率（Fig 3a,3b,3c），提示低浓度NO在金黄色葡萄球菌抵御万古霉素杀伤中发挥一定的保护作用，但对MgrA C12S菌株无此效应（Fig 3d,3e,3f）。以上结果表明，NOS产生的低浓度NO及其介导的MgrA S-亚硝基化修饰在促进金黄色葡萄球菌万古霉素耐药性过程中发挥了重要作用。
▲图3 MgrA的S-亚硝基化修饰帮助金黄色葡萄球菌抵御万古霉素清除
▼ 4.MgrA的S-亚硝基化修饰参与调控细胞壁厚度和自溶活性
VISA菌株常表现为细胞壁增厚及细胞自溶活性降低，因此作者检测了MgrA C12S突变株和ΔNOS菌株的细胞壁厚度及自溶活性，发现MgrA C12S突变株和ΔNOS菌株的细胞壁变薄（Fig 4a,4b）。qRT-PCR结果显示，NO介导的MgrA S-亚硝基化对细胞壁合成相关的信号通路基因转录无影响。自溶活性检测显示，较之于WT菌株，MgrA C12S突变株和ΔNOS菌株的自溶活性明显升高，添加SNP后，仅ΔNOS菌株自溶率减缓，MgrA C12S突变株自溶率无明显变化（Fig 4c, 4d）。qRT-PCR结果显示，与WT株相比，MgrA C12S突变株中自溶相关基因lytN和sarV的转录水平显著上调（Fig 4e）。添加SNP能下调WT菌株lytN和sarV的转录水平，但对MgrA C12S突变株基因转录水平无明显影响（Fig 4f）。以上结果表明，MgrA的S-亚硝基化修饰可能通过对自溶基因的调控进而调控细胞的自溶活性以及影响细胞壁厚度。
▲图4 MgrA的S-亚硝基化修饰参与调控细胞壁厚度和自溶活性
▼ 5.去除S-亚硝基化修饰导致MgrA的DNA结合能力减弱
有研究发现，MgrA可通过与下游靶基因的启动子结合发挥直接的调控作用，因此研究者猜测S-亚硝基化修饰可能会通过影响MgrA与其靶标基因的启动子结合进而发挥调控功能。作者通过染色质免疫沉淀(ChIP)-qPCR分析、凝胶阻滞迁移实验表明，MgrA的S-亚硝基化可以影响MgrA蛋白结合DNA的能力，从而调控自溶相关基因的转录（Fig 5）。
▲图5 去除S-亚硝基化修饰导致MgrA的DNA结合能力减弱
▼ 6.NO介导的WalR S-亚硝基化修饰促进菌株万古霉素抗性产生
作者进一步探索了其他转录因子的S-亚硝基化是否也可以调控细菌的万古霉素耐药性。金黄色葡萄球菌的双组分调控系统WalKR的反应调控因子WalR参与调控细菌自溶和细胞壁代谢，该蛋白被发现在第67位半胱氨酸发生了S-亚硝基化修饰。作者将walR 的C67位点突变后，发现WalR的C67S点突变菌株表现出与NOS敲除株和MgrA C12S突变菌株类似的现象，对万古霉素的抗性显著下降（Fig 6a-6c）、细胞壁变薄（Fig 6d,6e）以及细胞自溶活性增加（Fig 6f-6h）等表型。以上结果表明金黄色葡萄球菌内源产生的NO通过S-亚硝基化修饰介导的转录调控机制在细菌中可能具有普遍性。
▲图6 WalR的S-亚硝基化修饰调控细菌获得万古霉素耐药性
综上，该研究揭示了金黄色葡萄球菌NOS及其内源产生的NO通过介导靶蛋白的S-亚硝基化修饰以促进万古霉素耐药性发生的具体分子机制，有望为临床治疗VISA等耐药菌感染，研发新型抗生素提供新的思路和方向。
▲图7 S-亚硝基化修饰调控的转录促进金黄色葡萄球菌万古霉素耐药的机制示意图
戴媛媛
中国科学技术大学附属第一医院检验科副主任技师，博士，中华医学会检验分会第十届临床微生物学组委员、中华医学会细菌感染与耐药防治分会第一届委员会青年委员、安徽省检验医师协会青年委员、安徽省医学会细菌感染与耐药防治分会委员、全国血流感染细菌监测联盟（BRICS）委员。主持和参与完成国家级及省级课题多项，获安徽省科技进步一等奖一项，获安徽省卫健委“杰出人才”称号，以第一作者发表SCI及国内核心期刊论文多篇。
常文娇
中国科学技术大学附属第一医院检验科副主任技师，博士，安徽省卫健委“骨干人才”，中国医院协会临床微生物检验专委会委员、安徽省医学会热带病与寄生虫学分会委员。主持国家级自然科学基金1项，省级自然基金课题1项。参与国家级自然基金课题4项；作为第三完成年人获安徽省科技进步一等奖一项；以第一作者发表SCI及国内核心期刊论文多篇。
END
作者｜戴媛媛、常文娇（中国科学技术大学附属第一医院）
审校｜马筱玲（中国科学技术大学附属第一医院）