该研究以990 名结核病患者的家庭接触者为研究对象，通过IFN-γ释放试验（IGRA）检测，在基线时538例（54.3%）为潜伏性结核感染（LTBI）阳性，452例（45.6%）LTBI阴性（图1A）。研究者进而对452个LTBI阴性的家庭接触者进行了2年的随访，其中96例（21.2%）在2年的随访中成为IGRA⁺（转化者），而293例（64.8%）家庭接触者直到研究结束时仍为IGRA^-（未转化者）。为探索先天免疫反应在预防潜伏性结核感染转化中的作用，研究者分析了年龄和性别匹配的非转化者（n = 293）和转化者（n = 96）新鲜分离的外周血单个核细胞（PBMCs）免疫细胞群。结果表明，在基线时，非转化者的PBMCs中CD14⁺和CD3^-CD56⁺CD27⁺CCR7⁺记忆样NK细胞的百分比明显高于转化者（图1B）。在24个月随访时，记忆样NK细胞的百分比在转化者中显著降低，而在未转化者中保持稳定。这些发现表明先天免疫反应可能在预防LTBI转化中发挥重要角色。

▲图1. 结核病患者的家庭接触者队列的研究设计

大多数针对未转化者和转化者全血或PBMCs转录组的研究并没有使用结核分枝杆菌抗原作为刺激因子，其结果可能会受到与结核分枝杆菌接触无关的条件的干扰。为此，研究人员测定了转化者和未转化者的PBMC在未刺激和在结核分枝杆菌抗原ESAT-6和CFP-10刺激下的转录特征（图2AB），并通过qPCR验证转录组数据（图2C）。结果表明，CES1（羧酸酯酶）、Siglec-14（唾液酸结合IGG样凝集素）、RPS26（核糖体蛋白）、RGCC1（细胞周期调节因子）和ANXA1（膜联蛋白）的相对表达量最高。随后研究人员用未刺激和结核分枝杆菌刺激PBMCs分离纯化出的单核细胞、NK细胞和T细胞中测定了上述5种分子的表达。结果表明，所有5个分子都在这些细胞群中组成性表达（图2D-E），且单核细胞群体表达更高水平的Siglec-14，而未经过结核分枝杆菌刺激的CD14⁺细胞中的Siglec-14表达水平则没有改变。

▲图2. 结核病患者的家庭接触者PBMCs的全转录组测序分析

为进一步确定上述5个分子（CES1、Siglec-14、RPS26、RGCC1和ANXA1）对健康个体单核细胞来源的巨噬细胞（MDMs）中结核分枝杆菌生长的作用，研究者分离MDMs并转染针对这些分子的siRNA，然后感染结核分枝杆菌，结果表明，在感染后的第5天，相对于control组，转染Siglec-14 siRNA的MDMs中结核分枝杆菌的生长明显增强（图3A），而CES1、RPS26、RGCC1和ANXA1 siRNA并不影响结核分枝杆菌的生长。独创性通路分析表明Siglec-14可能在免疫及其下游靶点中发挥功能作用。为研究Siglec-14⁺细胞减慢巨噬细胞中结核分枝杆菌生长的机制，作者用Siglec-14 siRNA转染的MDMs，并用结核分枝杆菌H37Rv感染它们。结果表明，在凋亡、自噬、细胞因子和趋化因子的产生、结核分枝杆菌的活化方面，对照组和Siglec-14 siRNA处理组的细胞没有差异（图3B-D）。然而，Siglec-14 siRNA显著抑制MDMs的抗菌肽基因表达（图3E）。此外，相对于CD14⁺ Siglec-14^-细胞，CD14⁺ Siglec-14⁺细胞显著限制结核分枝杆菌的生长，并产生更高水平的抗菌肽（图3F-G）。

▲图3. Siglec-14通过抗菌肽的生产减少MDM中结核分枝杆菌的生长

代谢变化可以调节基因表达谱和免疫反应来应对感染。为了研究转化者和非转化者之间的血浆代谢组学特征是否存在差异，作者使用液相色谱-质谱分析了来自转化者（n=5）和非转化者（n=5）的血浆样本。结果表明，在两组之间存在显著差异的47种代谢物（图4A-B）。基于PLS-DA的预测评分确定了非转化者中的8种代谢产物显著高于转化者（图4C）。代谢物富集分析表明差异代谢产物主要富集于磷酸戊糖途径和α-亚麻酸、亚油酸、视黄醇、丁酸盐和类固醇生物合成途径（图4D）。

▲图4. 非转化者表现出不同的血浆代谢组学特征

为了进一步确定鉴定的代谢物对Siglec-14表达的影响，研究者培养了感染结核杆菌的CD14⁺单核细胞。在六种代谢物中，只有醋酸脱氧皮质酮能显著增强结核分枝杆菌在存在下培养的MDMs中的Siglec-14表达（图5A）。为鉴定出的代谢物对结核分枝杆菌生长的影响，研究者使用感染结核分枝杆菌H37Rv的MDMs，部分感染细胞补充了非转化者血浆中富集的6种代谢物。在测试的代谢物中，只有醋酸脱氧皮质酮能显著抑制结核分枝杆菌在MDMs中的复制（图5B）。为验证醋酸脱氧皮质酮的抗菌活性是否依赖于Siglec-14的表达，研究者将健康个体的MDMs转染Siglec-14 siRNA，并感染结核分枝杆菌H37Rv。结果表明，醋酸脱氧皮质酮显著抑制了对照组siRNA转染的MDMs中结核分枝杆菌的生长，而在转染Siglec-14 siRNA的MDMs中则没有抑制（图5C-D）。此外，只有醋酸脱氧皮质酮处理增强了感染结核分枝杆菌的MDMs产生的抗菌肽HBD2和S100A12，而这种作用被Siglec-14 siRNA所抑制（图5E）。

▲图5. 醋酸脱氧皮质酮治疗促进巨噬细胞中Siglec-14依赖性的抗菌活性

研究报道醋酸脱氧皮质酮治疗可提高基本代谢率。为确定醋酸脱氧皮质酮是否影响感染结核分枝杆菌的MDMs的代谢状态。研究者进行了代谢通量测定，分别检测氧化磷酸化和糖酵解的测量指标线粒体耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）的变化。在所有6种测试的代谢物中，醋酸脱氧皮质酮增强了感染结核分枝杆菌的MDMs的基础ECAR（图6A-D）。此外，醋酸脱氧皮质酮显著增加了ATP的产生和备用呼吸容量（图6C-D）。这些发现表明醋酸脱氧皮质酮可使结核分枝杆菌感染的MDM保持代谢活性状态，并通过增强Siglec-14表达来抑制结核分枝杆菌的生长。

▲图6. 醋酸脱氧皮质酮使MDMs处于糖酵解状态

研究者发现非转化者的PBMCs中具有更多的CCR7⁺记忆样NK细胞（图1B）。鉴于代谢物可以通过表观遗传修饰重新编程免疫效应细胞并增强其功能和增殖，研究者评估了代谢物对记忆样NK细胞扩增的影响。结果表明，4-羟基吡啶治疗显著增强了结核分枝杆菌刺激的PBMCs中记忆样NK细胞群的扩增（图7A-F），并显著提高结核分枝杆菌刺激的PBMCs的IFN-γ产量（图7G）。

▲图7. 代谢物增强了记忆样NK细胞的扩张和细胞因子的产生

总之，该研究采用全转录组学和代谢组学方法，发现长期接触结核病患者但仍未感染结核的人群对结核分枝杆菌先天免疫的新机制。这部分人群血浆中增加的代谢物——醋酸脱氧皮质酮和4-羟基吡啶能够调节结核分枝杆菌的代谢适应并防止感染的早期建立。这些发现为开发巨噬细胞和记忆样NK细胞介导的结核病免疫新方法奠定了基础。

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摘译｜肖阳华 （上海市肺科医院）

审校｜余方友 （上海市肺科医院）