2023-08-24 17:20
作者 霍秋月
京港感染论坛
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艰难拟梭菌感染（CDI）是医院相关性腹泻的主要原因，氟喹诺酮类抗生素耐药艰难拟梭菌的出现和其在全球广泛传播有关。甲硝唑和万古霉素是用于治疗CDI的两种主要抗生素，然而由于疗效的下降，在更新的IDSA/SHEA和ESCMID CDI治疗指南中，不再推荐将甲硝唑作为成年人CDI的一线药物，这意味着CDI治疗模式的重大转变。但目前对甲硝唑耐药的微生物遗传决定因素知之甚少。
该研究发表于《Nature Communications》（JCR分区Q1区，中科院期刊分区1区，2023年影响因子16.6），标题为《Decoding a cryptic mechanism of metronidazole resistance among globally disseminated fluoroquinolone-resistant Clostridioides difficile》，加拿大滑铁卢大学的Abiola O. Olaitan为该论文的第一作者，美国威斯康星大学的Caitlin S. Pepperell和加拿大滑铁卢大学的Julian G. Hurdl为该论文的通讯作者。
▼ 1.血红素介导甲硝唑耐药并减弱其细胞毒性
首先对不同核型和分支的艰难拟梭菌（C. difficile）在有或无血红素存在的情况下进行了对甲硝唑（MTZ）的药敏试验。结果发现在血红素存在时，菌株对甲硝唑耐药性增加（图1a）。R20291因其对甲硝唑表现出血红素依赖性耐药而被作为主要研究菌株。通过检测R20291在甲硝唑和血红素共同作用后的转录反应，结果表明血红素可减弱甲硝唑毒性相关通路的上调（图1b，c）。然而血红素并没有减弱甲硝唑敏感艰难拟梭菌CD196中与甲硝唑毒性相关的基因表达（图1d）。研究者假设血红素结合转录调节因子HsmA可能与血红素依赖性的甲硝唑耐药有关，但没有任何证据表明HsmA编码的血红素解毒系统参与介导血红素依赖性甲硝唑耐药（图1e, f）。
▲ 图1 血红素减弱甲硝唑在艰难拟梭菌中的细胞毒性
▼ 2.由-10启动子中的突变引起的nimB的持续转录与甲硝唑耐药性相关
艰难拟梭菌NimB（CdNimB）在细胞中起到氧化磷酸化合物的作用。当在R20291中敲除nimB后，该突变体对甲硝唑敏感性恢复（图2a）。在甲硝唑治疗失败的患者中，对比发现治疗前的MTZ敏感菌株23475和治疗第26天的MTZ耐药菌株23468的基因组间具有不可区分的核心基因组序列类型（图2b）。耐药菌株23468在预测的-10调控启动子区域进化出T到G的单核苷酸多态性（SNP）（图2c），将甲硝唑敏感的野生株和耐药突变株的SNP差异分别命名为PnimBT和PnimBG。通过qRT-PCR表明耐药菌株23468比敏感菌株23475的nimB转录本数量显著增高（图2d）。
携带PnimBT的CD196具有对甲硝唑较低的最低抑菌浓度（MIC），而携带PnimBG的R20291具有较高的MIC（图2e）。如图2f所示，在CD196和R20291中表达PnimBG::mCherryOpt的荧光强度高于表达PnimBT::mCherryOpt的荧光强度，这表明PnimBG相比PnimBT具有更强的启动子强度。沉默nimB后使耐药菌株对MTZ的敏感性恢复（图2g，h）。总之，这些数据表明血红素依赖性MTZ抗性与nimB的组成性转录有关，是由更强的启动子PnimBG驱动的。
▲图2 由-10启动子中的突变引起的nimB的持续转录与甲硝唑（MTZ）耐药性相关
▼ 3. CdNimB是一种结合血红素的硝基还原酶
CdNimB的组氨酸-55与瓦恩兰德固氮菌的血红素结合型氧化酶Anf3组氨酸-70同源（图3a, b）。为了确定关键残基，NimB变体（His55Ala, Cys56Ala, His61Ala和Tyr119Ala）通过定点诱变产生，Ala-55突变体是其中唯一不引起血红素依赖性抗性的变异（图3c）。Soret带（表示血红素与蛋白质的结合）的分光光度分析显示，CdNimB结合血红素并显示一个Soret带，但在His-55突变体中减少（图3d，e）。总之CdNimB是一种结合血红素的蛋白质，其可能的近端配体是组氨酸-55。
由于Nim蛋白被认为可将5-硝基咪唑的硝基还原为无毒的氨基衍生物，于是研究人员检测了在厌氧条件下CdNimB的硝基还原酶活性。在所有底物中，野生型CdNimB表现出明显高于Ala-55 CdNimB突变体的酶活性（图3f）。2-硝基咪唑是能够相对更稳定产生2-氨基咪唑的CdNimB的底物之一，研究者采用2-硝基咪唑作为底物，定量CdNimB酶和细胞硝基还原酶活性的氨基反应终产物（图3f）。在硝基还原酶测定中，NimB-ala-55在还原4-硝基苯甲酸和2-硝基咪唑方面效率较低（图3g, h）。LC-MS/MS分析证实，2-硝基咪唑被野生型CdNimB转化为2-氨基咪唑，而NimB His55Ala变体产生的氨基产物要少得多（图3i）。在不添加血红素的情况下，敏感菌株和耐药菌株产生的2-氨基咪唑的量接近，添加血红素可使在耐药菌株中的2-氨基咪唑产量增加（图3j)。这些发现表明CdNimB是一种硝基还原酶，以依赖血红素的方式将硝基咪唑转化为它们的氨基衍生物。
▲图3 CdNimB是一种结合血红素的硝基还原酶
▼ 4.自然种群对甲硝唑抗性的遗传分析
通过FST异常值分析鉴定在亚群中频率有显著差异的等位基因，同时使用PySeer线性模型来估计细菌群体中遗传变异对所关注表型的影响。两种方法都确定了两个SNPs与甲硝唑耐药性相关的极端异常值(图4a）。nimB启动子突变是这些SNPs之一，另一个与耐药相关的变异是gyrA中的245C>T突变(gyrase A中的Thr82Ile)，该突变赋予氟喹诺酮类药物耐药性。Thr82Ile突变与卫生保健相关的艰难梭菌的大流行传播有关。图4b显示了与甲硝唑敏感性和gyrA/nimB启动子等位基因有关的每个样本中的分离株。在Clade 1和Clade 2中，gyrA和PnimBG突变与大型克隆群相关联，表明具有这些变异的菌株传播迅速。
▲图4 PnimBG相关的甲硝唑耐药性与氟喹诺酮类耐药性和全球传播同时存在
综上所述，该研究发现大多数甲硝唑耐药的C. difficile菌株在nimB基因启动子中携带了一个T-to-G突变（PnimBG），导致基因的持续转录，沉默或删除nimB会消除甲硝唑耐药性。NimB与已知能够赋予硝基咪唑类抗生素耐药性的Nim蛋白有关，是一种依赖于血红素的黄素酶，可以降解硝基咪唑类化合物。此外，PnimBG突变的发生与DNA解旋酶中的Thr82Ile替换相关，这种替换赋予流行菌株对于氟喹诺酮类抗生素的耐药性。
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霍秋月
河北医科大学 2022级硕士研究生
END
作者｜霍秋月（河北医科大学）
审校｜王伟刚、赵建宏（河北医科大学第二医院、河北省临床检验中心）