为了探讨先天免疫系统和适应性免疫系统细胞与霍乱弧菌之间的相互作用，研究人员从人血中分离出中性粒细胞、CD4⁺ T细胞、自然杀伤（NK）细胞、B细胞和CD14⁺单核细胞，并将CD14⁺单核细胞诱导分化为巨噬细胞，同时还引入了由THP-1单核细胞系分化形成的巨噬细胞。将野生型霍乱弧菌与上述细胞共培养，用共聚焦显微镜观察到霍乱弧菌迅速附着在免疫细胞表面。随着时间的推移，细菌不断积累，并通过形成一个厚厚的多细胞层膜来定植于整个免疫细胞表面。利用单细胞分辨率活细胞显微镜追踪巨噬细胞表面每个新增细菌的来源，结果显示共培养的前80min内巨噬细胞表面黏附的多为共培养体系中浮游的细菌，后期则由表面已黏附的细菌分裂而来。

▲图1. 霍乱弧菌可在不同种类的人免疫细胞表面形成生物膜

研究人员随后利用RNA-seq对霍乱弧菌与巨噬细胞共培养期间进行了时间转录组学分析，结果显示有1577个基因在共培养期间显著上调，其中包括鞭毛基因、Ⅳ型菌毛（包括能力菌毛、甘露糖敏感的血凝素菌毛<MSHA>和毒素共调菌毛<TC>）基因和编码几种促进霍乱弧菌附着在生物和非生物表面的蛋白质的基因。为明确上述表达上调的基因对霍乱弧菌生物膜形成的影响，研究人员相继构建了上述基因的突变型菌株并进行验证，发现鞭毛协同MSHA菌毛介导了共培养初期（1h）霍乱弧菌对巨噬细胞的黏附，TC菌毛和TcpF蛋白则主要负责后期的黏附。此外，细菌的运动能力对细菌的黏附也至关重要，用非那米尔抑制细菌的运动后也显著降低了霍乱弧菌的黏附率。

▲图2. 鞭毛、MSHA菌毛和TC菌毛介导霍乱弧菌对巨噬细胞的黏附

霍乱弧菌在非生物表面形成的生物膜基质成分主要是Bap1、 RbmA和RbmC蛋白以及弧菌多糖（VPS），但其在巨噬细胞表面行成的生物膜基质则主要为MSHA菌毛、TC菌毛及TcpF蛋白。

研究人员通过免疫荧光直接对MSHA菌毛、TC菌毛和TcpF进行可视化和定量分析，发现它们确实存在于巨噬细胞的生物膜中：MSHA菌毛均匀地遍布整个生物膜，而TC菌毛和分泌的TcpF蛋白主要分布在巨噬细胞表面附近，且TcpF负责直接与巨噬细胞表面结合，TC菌毛进而与TcpF结合。此外，研究人员还发现TC菌毛赋予了霍乱弧菌生物膜更强大的机械应力，对巨噬细胞上的生物膜结构的分析显示，TC菌毛有助于在霍乱弧菌在巨噬细胞表面形成规则的排列形状。

▲图3.霍乱弧菌在巨噬细胞表面形成的生物膜基质主要

为MSHA菌毛、TC菌毛和TcpF蛋白

研究人员进一步探究了霍乱弧菌在巨噬细胞上形成的生物膜的功能。生物膜对巨噬细胞细胞因子的分泌干扰很小，但对巨噬细胞有直接杀伤作用，且形成的生物膜厚度与巨噬细胞的死亡率呈正相关。转录组学分析结果显示，霍乱弧菌的毒素基因在与巨噬细胞共培养期间大多表达增强，如霍乱毒素基因ctxAB，热溶血素基因tlh及溶血素基因hlx和hlyA等。在众多表达上调的毒素基因中，hlyA是最关键的，缺失hlyA基因的霍乱弧菌对巨噬细胞的杀伤能力明显减弱，而在霍乱弧菌中过表达hlyA进一步增强了其对巨噬细胞的杀伤能力。研究人员还发现巨噬细胞表面形成的生物膜也有助于HlyA杀伤巨噬细胞，缺乏生物膜形成能力的霍乱弧菌诱导的巨噬细胞死亡明显少于WT细菌，HlyA的分泌也显著减少。免疫荧光示踪分析显示，HlyA主要在巨噬细胞表面及其附近积累。可见，巨噬细胞上生物膜的形成通过在巨噬细胞表面附近富集高浓度可扩散的毒素HlyA，增强了霍乱弧菌杀死巨噬细胞的能力。不仅如此，HlyA的穿孔作用可使巨噬细胞裂解，进而导致胞内容物外泄，霍乱弧菌可在杀死巨噬细胞后利用其裂解的胞液生长，因此，杀死巨噬细胞是霍乱弧菌的一种掠食性策略。

▲图4.生物膜助力HlyA杀伤巨噬细胞

霍乱弧菌在人小肠中致病依赖其在肠上皮细胞的定植，为了研究霍乱弧菌在定植和突破小肠上皮细胞后是否能够在免疫细胞上形成生物膜，研究人员建立了一个来自人小肠类器官（肠类器官）和巨噬细胞（位于基底侧）的上皮单层细胞共培养模型。利用延时共聚焦显微镜观测，发现霍乱弧菌能持续侵袭肠上皮，破坏上皮完整性后到达基底侧并在巨噬细胞表面形成生物膜结构。霍乱弧菌在此环境中形成生物膜同样依赖鞭毛、MSHA菌毛和TC菌毛的存在。

▲图5. 霍乱弧菌侵袭人类肠上皮后在巨噬细胞表面形成生物膜

该研究主要得出了以下结论：①霍乱弧菌形成的生物膜不仅具备保护效应，还对免疫细胞有直接杀伤作用；②霍乱弧菌在免疫细胞表面形成的生物膜由鞭毛、MSHA菌毛、TC菌毛及TcpF蛋白介导；③杀死巨噬细胞是霍乱弧菌的一种掠食性策略。

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作者｜欧阳紫柔（河北医科大学）

审校｜王伟刚、赵建宏（河北医科大学第二医院、河北省临床检验中心）