▲图1：工程细菌检测肿瘤DNA

为了验证细菌可以检测到人类肿瘤DNA的假设，研究人员制备了转基因供体人类癌细胞和传感器细菌（图2a）。首先构建了一个包含卡那霉素抗性基因和GFP（kan^R-GFP）且两侧是来自人类KRAS基因同源性臂的供体盒，再使用慢病毒载体将该供体盒转导进RKO和LS174T人结直肠癌（CRC）细胞系。为了构建传感器细菌研究人员在贝氏不动杆菌（Acinetobacter baylyi）的中性基因组中插入一个具有KRAS同源臂的互补“着陆垫”序列，并测试了“大插入”设计（2kb）和“小插入”设计（8bp）两种方法（图2b-c）。在液体培养基和固体琼脂上使用各种来源的供体DNA（质粒、转基因癌细胞纯化的基因组、癌细胞裂解液）通过在抗性平板上的菌落计数测试这两种方法的水平基因转移效率。结果表明，“小插入”设计相较于“大插入”设计的细菌传感器对各种来源的供体DNA检测效率均提高了(图2d-g)。以上实验证明了细菌传感器检测细胞来源的基因不需要DNA纯化。

KRAS基因12号密码子的突变发生在27%的CRC肿瘤中，占所有CRC KRAS突变的72%。研究人员利用贝氏不动杆菌内源性的I-F型CRISPRCas系统检测细菌传感器是否能够区分野生型（KRAS）和突变型（KRASG12D）基因。针对KRASG12D突变的野生型KRAS序列设计了三个CRISPR间隔序列，并插入到细菌传感器基因组（图2h）。三个间隔序列中的两个同时阻断了野生型和突变型DNA的转化（图2i-j）。然而，在spacer2中突变型的突变消除了PAM位点，所以选择性地只允许突变型的供体DNA和细菌传感器自身的基因组发生重组。因此，该细菌传感器可以检测到KRAS基因中的单碱基特异性突变。

▲图2：体外检测KRASG12D DNA

体外类器官的培养真实的反映了体内器官的生物学情况，因此，研究人员在体外用类器官来评估传感器的功能。首先，构建了BTRZI小鼠类器官（当注射到小鼠结肠时，能诱发锯齿状结直肠癌）。将上述基因供体盒转导入类器官后，将其裂解液和小片段插入设计的贝氏不动杆菌传感器共培养（图3a），结果表明，该细菌传感器可以整合来自类器官裂解液的DNA（图3b）。接下来，将表达GFP的细菌传感器与供体类器官在基质凝胶上共培养24小时（图3a）。表达GFP的细菌传感器包裹了类器官（图3c），共培养后，细菌传感器仍通过水平基因转移获得了供体DNA（图3d）。

▲图3：从BTRZI-KRAS-kan^R类器官中检测供体DNA

上述细胞系和类器官中发生的从癌细胞到细菌的水平基因转移均发生在体外，接下来研究人员在体内测试了该系统。在证实了细菌传感器会在小鼠胃肠道定植，DNA会从肿瘤中释放后，进行了原位CRC实验。通过结肠镜注射CRC类器官以诱发小鼠的结直肠癌，通过病理切片确认。然后传感器细菌通过灌胃或灌肠的方式接种到小鼠体内，收集直肠和肠腔流出物在抗性平板上进行菌落计数分析。在接种了细菌传感器后，无论是灌胃还是灌肠（图4b，c），荷瘤小鼠体内的卡那霉素耐药的菌落数显著高于非肿瘤小鼠。通过ROC曲线分析，细菌传感器能很好的区分肿瘤小鼠和非肿瘤小鼠（图4d），且无论肿瘤大小如何，粪便里的平均菌落数相同（图4e）。

▲图4：通过灌胃或灌肠接种贝氏不动杆菌传感器细菌后在BTRZI-KRAS-kan^R荷瘤小鼠粪便中检测到水平基因转移

综上，在该研究中，细菌传感器可作为“哨兵”检测肠道内CRC脱落的肿瘤DNA，而无需样品制备或处理，且该传感器具有高度的敏感性和特异性。这种生物传感器在许多领域包括临床和非临床中均能发挥非常重要的应用，特别是在取样困难或取样方式具有侵袭性而且需要连续监测时。

▲点击图片，关注2023京港年会

摘译｜张娇（上海市肺科医院）

审校｜余方友（上海市肺科医院）