2023-10-09 17:20
作者 李佩纹
京港感染论坛
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碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌是临床上面临的重要公共卫生问题。在中国，碳青霉烯类药物的耐药性主要由产blaKPC型碳青霉烯酶引起，该酶基因常见于ST11型肺炎克雷伯菌的IncFII质粒上。宿主菌获得这些耐药质粒后常表现出对碳青霉烯类药物耐药，因此，blaKPC基因被认为是一个可组成性表达的基因。然而，关于宿主菌染色体编码的调控因子与可转移质粒上的blaKPC基因之间是否存在相互作用关系的研究较少；即通过宿主菌调控质粒携带的blaKPC基因表达的分子调控机制尚不清楚。
双组分系统（two-component system，TCS）是一种感受和传递外界变化的信号转导系统，通常由细胞膜上的组氨酸激酶（histidine kinase，HK）和胞内的应答调控蛋白（response regulator，RR）两部分组成。HK受到刺激后自动磷酸化，并将磷酸基团转移给RR，磷酸化后的RR会结合启动子，在转录水平上调控基因的表达。CpxAR是一种监测膜内稳态的TCS，CpxA为HK，CpxR为RR。激活后CpxR诱发下游基因cpxP高表达，其mRNA被进一步加工成一个小分子调控RNA CpxQ。CpxAR在多种细菌耐药中发挥着重要的作用，但目前并不清楚CpxAR是否可以直接调控外源可移动质粒上携带的耐药基因，本研究解决了这一问题。
该文章于2023年9月发表在《Emerging Microbes & Infections》杂志，标题为《CpxR promotes the carbapenem antibiotic resistance of Klebsiella pneumoniae by directly regulating the expression and the dissemination of blaKPC on the IncFII conjugative plasmid》，中国科学院上海免疫与感染研究所研究员晁彦杰和上海交通大学生命科学技术学院/微生物代谢国家重点实验室欧竑宇教授为该论文的共同通讯作者。晁彦杰课题组长期关注细菌与宿主在不同生理或病理条件下的转录组RNA变化和关键功能基因。欧竑宇教授长期从事微生物基因组学和生物信息学交叉研究，关注耐药条件致病菌比较组学分析。在这篇文章中，主要研究发现如下：
▼1. CpxR促进经典肺炎克雷伯菌（classical K. pneumoniae，cKP）和高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent K. pneumoniae，hvKP）对碳青霉烯类药物的耐药
为研究染色体编码的TCS如何调控blaKPC引起的肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药，研究者根据P2CS数据库检索结果，对ST11型碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌HS11286的基因组分别构建了24种TCS的突变体（图1），每一种突变体敲除了一种TCS的基因。通过纸片扩散法检测突变体对美罗培南的敏感性（图2），最后发现ΔTCS6 菌株（缺乏cpxAR）对美罗培南敏感性提高。
（http://www.p2cs.org/page.php?base=Klep11DB&PHPSESSID=f348d148824b3787e921c2d36c5260d8）
▲图1 24种TCS突变株
▲图2 各突变株纸片扩散法结果
然后进一步构建了仅敲除cpxR基因的变异株（(ΔcpxR），以证明cpxR影响肺炎克雷伯菌对美罗培南的敏感性。结果表明缺乏cpxR使肺炎克雷伯菌对美罗培南的敏感性增加（图3）。
▲图3 cpxAR相关变异株对美罗培南敏感性
▼2. CpxR直接结合blaKPC的启动子区域并上调blaKPC基因的表达
为了进一步验证CpxR如何影响菌株对碳青霉烯类药物的敏感性，研究者们进行了电泳迁移率实验（Electrophoretic mobility shift assays，EMSAs），发现CpxR与blaKPC的启动子区域高亲和力结合。失去C端或者改变关键的第195位精氨酸，CpxR无法与启动子区域结合（图4）。等温滴定量热法和DNA I 足迹法结果也表明CpxR会直接与blaKPC的启动子结合。这种结合不仅仅在中国流行的ST11型经典肺炎克雷伯菌的Tn1721转座子上观察到，欧美流行的ST258型肺炎克雷伯菌的Tn4401b转座子上也能观察到该现象。需要注意的是，两种结合区域有区别，需要进一步观察。
▲图4 EMSAs实验结果
在图4中展现了EMSAs实验的结果，研究者向各组加入了2 pmol的FAM标记的blaKPC启动子，野生型CpxR能够与之结合。（CpxR WT：CpxR野生型；CpxR NTD：CpxR缺失C端，CpxR是OmpR/PhoB转录调控子家族中的一员，C端为DNA结合区域；CpxR R195H：CpxR第195号位精氨酸突变为组氨酸）
在随后的体外实验中，使用lacZ报告基因检测了CpxR对blaKPC转录的具体影响。研究者们克隆了blaKPC启动子区域一段403 bp的序列，将它与没有启动子的lacZ基因融合，检测β-半乳糖苷酶的活性。当CpxR缺失时，blaKPC-lacZ的转录量显著降低（图5）。经过回补野生型菌株cpxR基因，转录量可恢复。据此证实CpxR可以上调blaKPC的转录。
▲图5 lacZ报告CpxR存在和缺失时对blaKPC转录的影响
如图5所示，红色图形代表的是blaKPC-lacZ组，当CpxR存在时，blaKPC-lacZ的转录量比CpxR缺失时更高。（null：未加入启动子，作为阴性对照；CpxP：lacZ融合cpxP基因（cpxR下游基因）的启动子作为阳性对照；blaKPC：lacZ融合blaKPC基因的启动子。本实验在一个以大肠埃希菌DH5αΔcpxR为替代宿主的异源系统中进行，并在质粒上提供了肺炎克雷伯菌cpxR基因。）
▼3. CpxR结合tra操纵子的启动子区域并促进耐药质粒的接合和转移
CpxR最初被认为是接合质粒表达（conjugative plasmid expression，cpx）的主要调控因子，已知可以抑制大肠埃希菌F质粒的接合。在这篇文章中，作者希望了解CpxR是否可以调控携带blaKPC的IncFII质粒在经典肺炎克雷伯菌、高毒力肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌之间的转移。首先，研究者们通过接合实验将pKPHS2质粒（cKP HS11286菌株携带blaKPC的IncFII质粒）转移到hvKP RJF293Z菌株中。再以携带pKPHS2质粒的hvKP RJF293Z菌株作为供体菌，大肠埃希菌EC600作为受体菌，进行接合实验，计算接合转移频率。当供体菌中缺乏CpxR（ΔcpxR）时，pKPHS2质粒的接合效率明显降低（图6）。当以携带pKPHS2质粒的EC600作为供体菌，hvKP RJF293Z作为受体菌，同样观察到了CpxR缺乏的供体菌可导致含blaKPC基因的耐药质粒的接合转移效率明显降低的现象（图6）。由此证明CpxR可促进携带blaKPC的IncFII质粒的高效转移。
▲图6 pKPHS2接合频率实验
肺炎克雷伯菌HS11286的pKPHS2质粒携带tra操纵子（图7），它可以调控质粒的接合转移。通过采用qRT-PCR方法检测tra基因的表达情况。结果显示，当缺乏CpxR时，tra操纵子包含的7个基因表达全部被抑制（图8）。traY-lacZ报告实验显示CpxR在转录水平上促进tra操纵子的表达。EMSAs和DNA I 足迹法证明CpxR直接与tra操纵子的第一个基因traY的启动子区域5’-CTCCAATGTAAGATTTATTAAAGGTTGGTAATCTTAC-3’结合（图9）。综上，CpxR通过激活pKPHS2上的tra操纵子来促进质粒的接合转移，从而促进碳青霉烯耐药性的传播。
▲图7 tra操纵子结构
▲图8 tra操纵子包含的7个基因表达全部被抑制
▲图9 DNA I 足迹法
在图9中虚线框中的峰明显降低，说明这部分是CpxR的结合部位。
▼ 4.总结
碳青霉烯耐药肠杆菌目细菌的出现对碳青霉烯类抗菌药物的有效性发起挑战。携带blaKPC质粒的转移是革兰阴性细菌耐药性传播的主要原因，大多数革兰阴性细菌都会在染色体上携带保守基因cpxR。这篇研究首次报告了CpxR会影响对碳青霉烯类抗菌药物的耐药性。为了解经典肺炎克雷伯菌和高毒力肺炎克雷伯菌中CpxR调控碳青霉烯酶基因质粒的机制提供了重要的依据。
▲图10 CpxR调控碳青霉烯酶基因质粒的机制
在图10中简要总结了CpxR调控碳青霉烯酶基因质粒的机制。宿主菌染色体基因cpxR编码蛋白CpxR。CpxR蛋白直接结合blaKPC的启动子和tra操纵子的第一个基因traY的启动子，促进blaKPC转录和质粒的接合转移，从而推动宿主菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药和耐药性的传播。
李佩纹
北京大学医学部医学技术研究院医学检验学2023级硕士研究生，导师：王晓娟副研究员。主要研究方向：肺炎克雷伯菌耐药机制研究。
END
作者｜李佩纹（北京大学医学部2023级医学技术研究院硕士研究生）
审校｜王晓娟（北京大学人民医院）