为了研究了肺炎支原体野生型（WT）菌株在肺中的存活情况和哪种给药途径载量高，研究者们对CD1小鼠进行气管内（IT）或鼻腔内（IN）接种，在感染后2天（2 dpi）测定肺和支气管肺泡灌洗液（BALF）中的细菌载量。结果发现由于气管内给药途径检测到的肺部样本细菌载量最高，接下来的实验均采用气管内给药（扩展数据图1a）。研究者们试图通过去除致病基因来设计一种改良的肺炎支原体菌株。他们发现一株编码社区获得性呼吸窘迫综合征毒素mpn372和编码具有细胞毒性核酸酶活性的脂蛋白mpn133基因缺失的肺炎支原体菌株（CV2株）在乳腺感染模型中减弱。且由于衰减在呼吸道中可能存在差异，而粘连等其他因素也可能影响毒力，他们将编码P30黏附蛋白的mpn453基因的缺失作为一个额外的基因来研究，以获得衰减的肺底盘。在本研究中，他们观察到，与野生株相比，不粘附的Δmpn453株在小鼠肺中有显著的菌落减少（扩展数据图1b），这表明与上皮细胞的附着对于维持肺中的肺炎支原体是至关重要的。因此，对于肺炎支原体在肺内的衰减和维持之间，研究者们折中选择mpn372和mpn133基因缺失的CV2菌株用于肺感染的治疗。他们同样通过动物感染模型来检测WT与CV2菌株相比在肺的定植潜力，发现在2、4和14 dpi下WT和CV2菌株的细菌计数相似（扩展数据图1c和表1），表明mpn372和mpn133基因的缺失并不影响CV2菌株在肺的定植能力。

▲扩展数据图1. 本研究中产生的肺炎支原体WT及突变株|的传递途径和肺部感染动态

表1.WT或CV2肺炎支原体菌株肺部感染的剂量反应

研究者们为了比较CV2菌株和WT菌株的免疫反应，他们构建小鼠肺部感染模型并通过菌落计数来确定肺组织中的细菌载量。此外，他们通过组织病理学和细胞因子谱分别评估病变和免疫反应。值得注意的是，他们发现感染后不同时间和不同肺叶的菌株之间的菌落数没有统计学差异（扩展数据图2a）。这一结果表明，气管内接种时，肺炎支原体菌株分布均匀，且证实CV2菌株基因缺失不影响其肺部的生存率。然后，他们通过三个主要肺叶（右、右中和左肺叶）的组织病理学分析，使用五个参数评估肺病变，计算出最高26分的最终总分，作为肺部病变的整体指标。

在2 dpi，与WT组相比，CV2感染的小鼠病变明显较轻（平均5.8分和12.1分），细支气管周围和血管周围炎症减少，间质炎症明显减少。在14 dpi，CV2组与PBS对照组相比没有显著差异，而WT组有细支气管周围、血管周围和间质炎症相关的残余组织损伤（WT评分为6分，CV2评分为1.7分）。在45 dpi，结果表明CV2和WT组的肺病变都得到了解决（图1a、b、扩展数据图2b）。为了观察WT和CV2菌株对小鼠体内的炎症标志物的影响，研究者们通过RT-qPCR检测了il1b、il6、il12a、il23a、ifng、tnf、ccl2、ccl3和cxcl1基因的表达水平（图1c、扩展数据图2c）。他们观察到WT和CV2对il1b、il6、il12a和il23a基因没有显著的差异（扩展数据图2c）。在2 dpi时，与PBS对照组小鼠相比，WT株诱导了炎症标志物tnf、cxcl1、ccl3、ccl2和ifng的表达，而与WT小鼠相比，CV2没有诱导任何标记物。在14和45 dpi时，与组织病理学分析一致，WT和CV2肺中的炎症反应都下降到PBS对照组小鼠的水平（图1c）。综上所述，这些结果表明，与WT肺炎支原体菌株相比，CV2肺炎支原体在肺部的毒性减弱，这突显了CV2作为进一步工程治疗呼吸系统疾病的底盘的强大候选。

铜绿假单胞菌是引起呼吸机相关肺炎（VAP）的主要致病菌之一，为了在底盘中引入治疗肺部传染病的特性，研究者们设计了一个最佳的遗传系统，以分散铜绿假单胞菌生物膜。由于铜绿假单胞菌的生物膜主要由多糖Pel、PsI和海藻酸盐组成，因此，研究者们设计了一个基因盒，表达了针对这三种多糖的三种酶，即糖苷水解酶PelAh64和PslGh55，以及融合到肽分泌的A1-II'海藻酸裂解酶（MPN142_OPT）。首先，他们用质谱法确认了PelAh、PslGh和A1-II' 在CV2_HA细胞裂解液和上清液中的表达。然后，他们通过结晶紫试验检测了表达单个酶或一些可能的酶组合的不同肺炎支原体菌株上清液对铜绿假单胞菌的抗生素膜活性。他们发现，结合三种酶的工程肺炎支原体菌株对铜绿假单胞菌菌株SAT290和PAO1形成的生物膜表现出最好的分散活性（图2a、b）。当使用阿尔新蓝生物膜染色方法时，他们得到了类似的结果（扩展数据图3a）。因此，他们将PelAh、PslGh和A1-II'纳入CV2弱毒株中，即CV2_HA菌株。最后，他们在一组临床铜绿假单胞菌中证实了CV2_HA的抗生素膜活性（图2c）。上述结果表明，表达和分泌糖苷水解酶PelAh和PslGh以及A1-II'海藻酸裂解酶的肺炎支原体菌株CV2能够在体外降解铜绿假单胞菌生物膜。

▲图2. 肺炎支原体菌株的生物膜扩散活性

▲扩展数据图3. CV2_HA对铜绿假单胞菌PAO1生物膜及生长的影响

理想的工程肺炎支原体菌株治疗呼吸机引起的肺炎应结合生物膜扩散和抗菌活性。为了引入抗菌活性，研究者们设计了CV2_HA来表达细菌素pyocin L1（CV2_HA_P1），该菌素之前被证明可以杀死一些铜绿假单胞菌菌株，包括PAO1。首先，他们用结晶紫来确定CV2_HA_P1的无细胞上清液溶解两种不同的铜绿假单胞菌菌株形成的生物膜的能力（图3a）和菌落计数（扩展数据图3b）。随后，他们研究了CV2_HA_P1对四种不同铜绿假单胞菌的抗菌性能。他们发现CV2_HA_P1抑制了PAO1的生长，对NCTC13437和BAA-2113菌株表现出适度的活性，但对Boston 41501菌株没有活性（图3b和扩展数据图3c）。为了使抗菌谱多样化，他们表达了pyocin S5而不是pyocin L1，这一结果使铜绿假单胞菌 Boston菌株的生长受到抑制（扩展数据图4a）。这些结果表明了菌株CV2_HA_P1对铜绿假单胞菌表现出抗菌膜活性和抗菌活性，且工程菌株的抗菌活性可以通过引入不同的抗菌素来对调节铜绿假单胞菌菌株的抗菌活性。

▲图3. CV2_HA_P1菌株的生物膜分布及体外抗菌活性研究

▲扩展数据图4. 抗生素对菌株生长曲线和生物膜形成影响的研究

由于肺炎支原体缺乏细胞壁，研究者们推测它可以与针对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞壁肽聚糖的抗生素联合使用。为了验证这一假设，他们评估了临床常用抗生素对肺炎支原体和不同铜绿假单胞菌菌株生长的影响（表2及扩展数据图4b）。正如预期的那样，他们发现没有针对细胞壁的抗生素杀死了CV2_HA菌株，而所有抗生素对大多数铜绿假单胞菌菌株都有活性（表2）。值得注意的是，尽管抗生素没有在任何显著程度上溶解铜绿假单胞菌的生物膜，但与CV2_HA_P1菌株孵育有效地溶解了生物膜（扩展数据图4c）。

为了评估CV2_HA_P1菌株在体内形成生物膜的溶解效果，研究人员处理了从ICU接受机械通气的VAP患者获得的ETTs切片。他们将16个ETT切片中的14个纳入最终分析，每个处理组的分布如下：对照组（n = 3）、头孢托罗烷/他唑巴坦（C/T）（n = 4）、CV2_HA_P1（n = 4）和CV2_HA_P1 + C/T（n = 3、图4）。经过24小时的孵育，铜绿假单胞菌载量在对照组和处理组之间显示出显著差异（图4b）：经抗生素处理的ETT生物膜降低了铜绿假单胞菌的负荷，在单独使用CV2_HA_P1或与C/T抗生素联合使用时，这种减少更明显。这些结果表明CV2_HA_P1对不同耐多药铜绿假单胞菌临床菌株形成的生物膜具有广谱活性。

表2. 肺炎支原体和铜绿假单胞菌SAT290、PAO1和C117对不同抗生素的敏感性

▲图4. VAP患者ETTs上的生物膜分布

为了研究CV2_HA_P1在体内的功效，研究者们通过小鼠感染模型，并进行组织病理学和细胞因子测量分析2、14和45 dpi的肺来检测其毒性（扩展数据图5）。在2 dpi， WT和CV2_HA_P1菌株接种的肺中恢复了相同的细菌载量；然而，与WT组相比，CV2_HA_P1组的肺改变明显较少（P<0.05）。在14和45 dpi时，CV2_HA_P1组的肺中未检测到菌落，组织病理学总评分与PBS对照组无显著差异；与此形成鲜明对比的是，WT感染的肺部仍然有组织病变（扩展数据图5a-c）。对炎症标志物的研究证实了病变的消退和工程CV2_HA_P1菌株的衰减（扩展数据图5d）。

▲扩展数据图5. 10⁸ CFUs的肺炎支原体WT和CV2_HA_P1菌株感染肺的组织病变和炎症反应

接下来，研究者们使用PAO1建立小鼠急性肺部感染模型。他们用环磷酰胺对小鼠进行免疫抑制，并接种不同数量的铜绿假单胞菌PAO1菌株（每组8只小鼠）。在不同时间点评估小鼠存活率、体重和临床状况（扩展数据图6a-d）。根据这些结果，他们决定使用每只小鼠接种1 × 10³CFU的PAO1，可以确保感染小鼠在不治疗的情况下肺定殖，并能存活更长的时间，从而可以监测底盘的治疗效果。

▲扩展数据图6. 铜绿假单胞菌急性感染模型的建立

接下来，研究人员在建立的肺部感染模型中研究了CV2_HA_P1降低PAO1负荷的效果（图5a）。研究人员用PAO1菌株感染小鼠，各组小鼠均存活至26 h，此时体重下降，临床评分为2分，但无其他临床恶化迹象。他们在26 h处死小鼠并计算了肺部的细菌负担。在肺部检测到CV2和CV2_HA_P1的菌落（扩展数据图7），这表明在铜绿假单胞菌等更严重的致病菌存在时，肺炎支原体可以在肺部定植。用1×10⁸ CFU CV2_HA_P1治疗的小鼠与PBS或CV2对照组相比，肺中的PAO1负荷显著降低（分别降低3.65log₁₀和4.39log₁₀；图5 b）。组织病理学的结果与PAO1负荷的降低相一致。他们观察到，与对照组相比，使用CV2_HA_P1治疗的小鼠肺部病变总评分显著降低（图5c），血管周炎症减少，实质性肺炎明显减少。与CV2组相比，CV2_HA_P1小鼠肺部的炎症标志物也减少（图5d）。这些数据表明，CV2_HA_P1治疗减少了急性肺炎体内模型的PAO1肺部感染。

为了研究CV2_HA_P1治疗在26 h以上的效果，他们接下来分析了小鼠在感染PAO1后几天的存活率（图5e）。约50%的小鼠感染了PAO1并用CV2_HA_P1处理存活到8 dpi，而用CV2或PBS对照组处理的小鼠存活到2 dpi。此外，组织学上PAO1感染的小鼠存活到8 dpi这个时间点显示，与CV2或PBS对照组相比，CV2_HA_P1组的肺功能改变大大减少（图5f）。这些数据表明，CV2_HA_P1治疗减少了PAO1的肺部感染，提高了小鼠存活率。

▲图5. 急性呼吸道PAO1感染小鼠的体内治疗

▲扩展数据图7. 在疗效测定的动物肺中检测到肺炎支原体

他们还研究了CV2_HA_P1作为预防PAO1感染的疗效（扩展数据图8a）。他们用肺炎支原体（WT_HA_P1或CV2_HA_P1）和PAO1感染小鼠，直到8 dpi，从所有组中恢复了肺部的肺炎支原体菌落数（扩展数据图8b）。与未处理的对照组小鼠相比，WT_HA_P1或CV2_HA_P1菌株治疗小鼠肺部的PAO1菌落显著减少（扩展数据图8c）。

综合来看，这些结果证明了研究人员设计的工程肺炎支原体菌株CV2_HA_P1在小鼠模型中能够有效治疗急性PAO1感染。

▲扩展数据图8. CV2_HA_P1对PAO1所致肺炎的预防作用

总之，该研究在肺炎支原体中引入了对铜绿假单胞菌生物膜有明显抑制作用的糖苷水解酶PelAh54和PslGh55以及A1-II '海藻酸裂解酶三种酶和具有抗菌活性的凝血素L1或凝血素S5的基因，从而获得了能够有效地溶解铜绿假单胞菌不同粘液样菌株形成的生物膜且具有抗菌活性的工程菌株（CV2_HA_P1）。通过使用工程菌株来抑制铜绿假单胞菌感染和溶解气管插管生物被膜，可以为抗菌治疗提供新的策略。这个方法还有望应用于其它类似感染的治疗中，为相关疾病的防治提供新的思路，为临床实践提供更多的选择。

摘译｜饶璐琳（绍兴市人民医院）

审校｜余方友（上海市肺科医院）