维生素D（VID）作为一种脂溶性维生素，通过与VID受体（VDR）的结合发挥生物学效应，具有调节钙、磷代谢和维持骨稳态的作用。除此之外，VID在调节人体免疫方面也发挥着重大作用，VDR和VID的代谢酶存在于单核细胞、巨噬细胞、活化的T、B细胞中，表明VID对先天性和适应性免疫具有免疫调节作用。VID对巨噬细胞的生物学效应包括：（1）诱导抗菌肽和防御素的表达（2）下调CD80、CD86和IL12以刺激T细胞（3）上调P选择素糖蛋白配体1（SELPLG）和整合素β-1（ITGB1）诱导组织粘附（4）通过调节IL-1β、IL6、IL12、TNF-a、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CCL2和miRNA-155的编码基因的来发挥控制炎症的作用。但VID对巨噬细胞的作用机制却知之甚少。本实验将人类单核细胞源的巨噬细胞体外平均分为两份，一份以1nM1,25（OH）2D3为培养基培养6天，此为实验组（D3-MDMs），另一份用1%乙醇处理作为对照组（MDMs），研究VID对巨噬细胞表达基因的影响。

▼ 二、D3-MDMs对病原菌、炎症和细胞应激的基因表达增强

▼ 三、D3-MDMs蛋白质-蛋白质相互作用分析

对差异基因进行蛋白质-蛋白质相互作用分析（Fig.3），分析显示，CXCL8、IL-1β和激酶插入结构域受体（KDR）基因相互作用数量最多，这表明VID在巨噬细胞转录重编码中发挥了重要作用。

▲Fig3 蛋白质-蛋白质作用网图

为研究实验组巨噬细胞基因表达是否与转录控制有关，进行转录因子（TF）的分析。Venn图显示，在人类中报道的近1500个TF中，MDM和D3- MDM表达了895个（Fig.4a）。这些TF因子可以激活对免疫基因来对抗病菌，以此调节巨噬细胞功能。在895个表达的TF中，D3-MDM组发现10个(2倍以上)TF的表达。在这10个基因中，有5个基因上调，包括MYCL、TBX21、NFIAL、FOXP4和 HOPX；5个基因下调，包括SMAD3、MLXIPL、POU3F1、GRHL1和EPAS1（Fig.4b）。已证明，FOXP1有巨噬细胞分化功能、IRF1和NFIA与宿主炎症及抗菌有关、MYCL激活Tcell、SMAD3控制抗炎表型、MLXIPL和EPAS1与氧化代谢有关、MLXIPL与免疫抑制有关、EPAS1和代谢相关。转录分析表明，巨噬细胞转录过程中，除了VDR，VID也可以发挥转录调节的作用。本文还分析了启动子序列不同转录基因的富集情况，上调和下调启动子基因都含有VDR的富集（Fig.4c+4d），这意味着VDR在转录基因表达中有激活因子或抑制因子的双重作用。此外还发现了与细胞增殖和分化(ESR1和FOXP1)、 细胞生长(CEBP: AP1和PLAGL1)相关的TF，以及参与免疫应答(IRF1)的TF（Fig.4c）。

▲Fig4 D3-MDMs转录因子调节基因表达

接下来，研究D3-MDMs的miRNAs的变化情况，在人类2654个成熟miRNAs中 ，D3-MDMs中表达364个，其中17个miRNAs的表达显著异常｛|fold change|≥ 1.5，（FDR≤ 0.05）｝，7个表达上调，10个表达下调 （Fig.5a）。主成分分析 (PCA)和热成像图显示miRNAs的表达谱在MDMs和D3-MDMs中是不同的 （Fig.5b）。表达异常的miRNAs在细胞中转录量较低 (TPM在10到1000之间)，其中miR-6501-3p、miR-665、miR-1972、miR-1183和 miR-619-5p基因表达下调将近四倍（Fig.5c）。本文还探讨了miRNAs的差异表达是否依赖于VDR，为此重新分析了VID培养THP1巨噬细胞24小时后的ChIP-seq数据，分析显示，VDR仅与 SSH1基因内含子区域的miR-619-5p基因位点相关（Fig.5d），这表明在D3-MDMs中只有miR-619-5p是VDR直接靶点。结果表明，miRNA在D3-MDMs和MDMs中，转录后的调节存在实质性差异。

▲Fig5 D3-MDMs的miRNA特征图

为了解miRNA对D3-MDMs的影响，进行了在相同样品中miRNA和靶mRNAs效应之间失调表达的对比，以此确认由miNRA调节的炎症表型、呼吸道爆发和Tcell激活等生物进程，结果表明，在D3-MDM中有17个表达显著异常的miRNAs，其中13个预测了mRNAs靶标，这13个miRNAs与147个mRNAs发生了交互作用，大部分是影响与炎症和细胞应激表型相关的mRNAs，意味着miRNAs目标有多样性。上调基因miR-1972通过作用于EDN1、CD274和PDCD1LG2靶点，对呼吸道爆发和Tcell激活进行调节。在下调的miRNA中，miR-1273h-5p有25个mRNA靶点(Fig.6a)，如ALOX5、ANGPTL4、CD274、CD38和IL-1β，该miRNA的靶基因与炎症相关(Fig.6b)。同样NRA-Seq分析显示：miR6501-3P下调，NOD2mRNA增多。本文还发现了一些miNRAs在免疫反应中起关键作用：（1）MiR-655作用于Wnt5ɑ/β-Catenin利于细胞增殖，MiR-655作用于TRIM8起抑制细胞凋亡作用（2）miR-511-3的上调与M2型巨噬细胞有关（3）miR-551b-5p调节炎症反应，miR-422a作用与转录因子家族的SMAD靶点（4）还发现miR-422a的上调和SMAD3的下调，但它们的生物功能需进一步研究。对miRNA-mRNA进行整合分析，显示了miRNA对靶向基因不同的的调控通路，miR-1972、miR-1273h-5p和miR-665可调节与炎症反应相关的基因PDCD1LG2、il -1β和CD274(Fig.6c)。(Fig.6c)。将基因富集分析与冲积图结合起来能更好阐明mRNA和miRNAs相互作用功能。

▲Fig6 D3-MDMmiRNAs靶基因相互作用图

通过mRNA-Seq和miRNA-Seq研究发现，体外巨噬细胞在维生素D3作用下， 巨噬细胞的基因表达发生了改变，增强了对病原体反应和呼吸爆发反应能力。