布鲁氏菌病是一种由布鲁氏菌引起的人兽共患性全身传染病，给畜牧业造成巨大的经济损失，对人类健康安全构成严重威胁。布鲁氏菌有很强的感染能力，人群普遍易感。感染布鲁氏菌的患者可出现反复发热、大汗淋漓、关节痛、腰背痛、乏力、肝脾肿大等症状^[1]。人类通过接触感染动物的分泌物、体液、尸体；食入污染的肉类、奶品；吸入含菌的尘土等多种途径而感染；此外研究表明人与人之间亦可以传播布鲁氏菌病^[2]。布鲁氏菌病经规范治疗大部分可以治愈，但若未及时治疗，可转变为慢性感染，导致病情复杂、治疗效果差，个别患者未及时规范诊治可导致死亡^[3，4]，因此，早期精准地对布鲁氏菌感染进行治疗具有极重要的意义。本文介绍的是布鲁氏菌从感染发热到治愈的诊疗过程及实验室如何在早期快速的锁定病原菌，提高临床诊疗效率。

血气分析：氧分压115.3 mmHg↑，标准碳酸氢根25.2 mmol/L↑。血常规[住院]：红细胞计数3.21×10^12/L↓，血红蛋白浓度94.0 g/L↓。降钙素原检测PCT（电化学发光法）：0.521 ng/ml↑。C—反应蛋白测定（CRP）：23.45 mg/L↑。心肌酶谱五项：α羟基丁酸脱氢酶197.5 U/L↑。肝功能八项：白蛋白31.3 g/L↓。血浆D－二聚体测定（D-Di）：D－二聚体1.21 μg/ml↑。凝血四项：活化部分凝血活酶时间46.7 S↑，纤维蛋白原4.24 g/L↑。电解质四项、肾功能三项、 葡萄糖测定（空腹）等未见明显异常。

2023-09-24日至30日县医院外送灌洗液NGS：惠普尔养障体，热带念珠菌，克柔念珠菌，烟曲菌，单纯疱疹病毒1型（HSV-1），EB病毒，肠道病毒。血培养（县医院）：木糖葡萄球菌，予哌拉西林钠他唑巴坦钠+依替米星抗感染治疗，患者仍有发热，因发现右大腿外侧可疑圆形红晕，疑似恙虫病可能2023-09-28开始加用多西环素抗感染治疗。

2023年10月04日 血培养（市医院）单侧报阳，直接涂片革兰染色如图1，镜下可见成堆聚集细沙样的革兰氏阴性短小球杆菌，形似布鲁菌属；随即进行柯氏染色，结果为：阳性，如图2；柯氏染色阴性对照大肠埃希菌ATCC 25922如图3；血培养瓶转种血平板+巧克力琼脂平板。

2023年10月05日 菌株培养24h细小，继续培养，如图4。

2023年10月06日 菌株培养48h呈圆形、凸起、光滑、较小的灰色菌落，如图5；质谱鉴定：马耳他布鲁菌 分值9.672，特征性质谱峰图 如图6。

▲图1 血培养直接涂片镜检

▲图2 血培养直接涂片柯氏染色  阳性

▲图3 柯氏染色阴性对照：大肠埃希菌ATCC25922

▲图4 血培养瓶转血平板5% CO₂培养24 h

▲图5 血培养转血平板5% CO₂培养48h

▲图6 马耳他布鲁菌特征性质谱峰图

在某县人民医院住院WBC 4.25*10^9/L，N 55.4%，CRP：24.4 mg/L。肺部CT提示两肺肺炎，考虑肺部感染，给予莫西沙星+多西环素抗感染治疗。

2023年10月01日 患者，诉仍有发热，伴畏寒、寒战，偶有咳嗽，无胸闷、胸痛，无腹痛、腹泻等不适，以“反复发热10天”为主诉转入某市医院。降钙素原测定 :0.521 ng/ml↑。C—反应蛋白测定：23.45 mg/L↑。查体：T:36.2℃，P:82次/分，R:20次/分，BP:135/75 mmHg；不除外非典型菌感染可能，继续予多西环素联合莫西沙星抗感染治疗。

2023年10月02日 患者诉仍有发热，伴畏寒、寒战，体温高峰较前变化不大，偶有咳嗽，无胸闷、胸痛，无腹痛、腹泻，无头晕头痛等不适。常规心电图检查（住院床旁十二导联）如图7：窦性心律 QT 间期延长。停用莫西沙星，改为氨苄西林舒巴坦抗感染治疗。

▲图7 常规心电图

2023年10月05日 患者无发热，无畏寒、寒战，偶有咳嗽，无胸闷、胸痛，无腹痛、腹泻，无头晕头痛等不适，治疗有效，继续多西环素和氨苄西林舒巴坦抗感染治疗。

2023年10月07日 患者无发热，情况良好，可予办理出院，诊断为布鲁病，随诊日期：2023年10月14日。出院带药：盐酸多西环素片 0.1g q12h 口服；利福定胶囊3粒 qd 口服。

2023年10月13日 患者体温正常，炎症指标正常。

布鲁氏菌病是人兽共患传染病，主要在牧区流行，但随着交通便利，在其他城市亦可见布鲁氏菌病散发。因布鲁氏菌病临床表现多样且缺乏特异性，再加上非牧区地理位置原因，容易漏诊进而延误布鲁氏菌病诊治，导致布鲁氏菌病转为亚急性甚至慢性，最终导致病情复杂、治疗效果差^[5]  。

本案病例患者来自某县城，在当地县人民医院住院时并未检出马耳他布鲁菌。由于县级医院鉴定布鲁菌的条件有限，不排除漏检的可能。在县医院住院期间因发现右大腿外侧可疑圆形红晕，疑似恙虫病可能，使用多西环素抗感染治疗。布鲁氏菌病诊疗指南中多西环素是治疗布鲁菌的药物之一^[6]，10月7日血培养报告马耳他布鲁菌时患者已无发热，无畏寒、寒战等不适，提示治疗有效。医生接到血培养检出马耳他布鲁菌的报告后改用盐酸多西环素片 0.1g q12h 口服；利福平胶囊3粒qd口服，符合布鲁氏菌病诊疗指南^[6]。10月13日患者到门诊复查，已无明显感染指征。

鉴定布鲁菌的方法很多，但基层医院因实验条件限制易出现漏诊或者误诊。基层医院通常根据流行病史、形态学及快速脲酶试验可辅助诊断，但对柯氏染色的了解并不多。

本案例在血培养报阳当天通过柯氏染色快速锁定布鲁菌，鉴定过程中做好了相关的防护。布鲁菌革兰染色着色弱，镜下呈细沙状，偶见双极浓染， 柯氏染色呈淡红色球杆菌。苍白杆菌与假苍白杆菌同属布鲁菌科，与布鲁菌具有很高的同源性。人苍白杆菌、中间苍白杆菌、嗜血苍白杆菌、解糖精假苍白杆菌柯氏染色法也可呈阳性。这些近缘菌可根据镜下形态、菌落形态以及自然生境的不同，与布鲁菌相鉴别^[7]。基层微生物室在血培养报阳涂片镜检发现成堆聚集细沙样的革兰氏阴性短小球杆菌即可进行柯氏染色，柯氏染色阳性有助于尽早鉴别出布鲁菌。

可见柯氏染色在布鲁菌的鉴定上有着速度快，成本低的特点，尤其适用于基层实验室，可作为布鲁菌初步鉴定的方法之一。

布鲁菌的鉴定要点：

1 革兰染色镜下可见革兰阴性、短小球杆菌，血培养直接涂片可见成堆聚集细沙样的革兰氏阴性短小球杆菌。

2 柯氏染色阳性。

3 快速脲酶试验阳性。

4 微生物鉴定仪。

5 微生物质谱仪。

柯氏染色：

染液：沙黄染液、亚甲蓝染液。

*步骤：

1 固定后滴加沙黄溶液，并用酒精灯加热至沙黄溶液冒出热气（热度不足会出现假阴性，但不可加热至沸腾。）

2 流水冲洗至无色

3 滴加亚甲蓝溶液，染色1 min左右冲洗即可。

*注意事项：

1 布鲁菌具有传染性，操作的过程中应注意生物安全，制片过程应在生物安全柜里完成。

2 制片一次制作2张片，避免染色不顺利时重新制片带来的风险。

3 染色时需要使用大肠埃希菌（ATCC 25922）作为阴性对照。