IBD是一种免疫介导的慢性炎症性疾病，与遗传和环境因素等有关。REG3A和REG3G等REG3家族成员可以通过消除病原微生物维持肠道屏障的完整性。然而，有研究发现IBD患者中存在REG3基因过表达。NOD2是维持肠道内稳态的关键识别受体，NOD2的变异是IBD最强遗传危险因素之一。已有研究证明肠球菌可激活NOD2，使肠道易受REG3介导的损伤，并在IBD患者肠道中丰度减少。因此，Jang等人推测，这些细菌在IBD中可能具有抗炎特性。本文研究团队提出了一项重要的研究，阐明了IBD中REG3、肠球菌和NOD2免疫通路的保护和致病功能。

16S核糖体RNA（rRNA）测序显示，IBD和非IBD群体的微生物群组成相似（图2A和2B），证实非IBD队列是IBD组的合适对照。与体外研究结果一致（图1），IBD患者中肠球菌的相对丰度低于非IBD患者（图2C）。粪便培养结果显示IBD标本中总肠球菌和Efm的检出率均显著低于非IBD组（图2D）。非IBD患者粪便中Efm特异性DNA的频率高于IBD组（图2E和2F）。同时，IBD粪便中的总肠球菌和Efm CFUs分别与REG3A浓度（图2G）、疾病的严重程度（图2H）呈负相关。

▲图2 IBD患者肠道菌群中的Efm等肠球菌减少

研究者在优化DSS诱导的结肠炎小鼠模型时发现，两个房间内饲养的同一胎体的野生型小鼠的易感性存在极端差异。与13房间（Rm13）饲养的结肠炎小鼠相比，6房间（Rm6）小鼠的死亡率和疾病评分较高、体重显著减轻、粪便Lipocalin-2（LCN2）较高、结肠明显缩短以及内源性肠球菌丰度显著下降（图3A-3F）。与人类样本相似，DSS诱导的结肠炎小鼠肠道中肠球菌水平下降（图3G）。因此，研究者选用Rm 6的小鼠进行随后的实验。

与未定植Efm的结肠炎小鼠相比，定植Efm的小鼠肠道炎症显著减轻（图3H-3L）。研究者将3种来自非IBD患者的Efm分离株在小鼠肠道定植之后，体重减轻和结肠缩短较少（图3M、3N）。与Nod2^+/-小鼠相比，Nod2^-/-小鼠肠道定植Efm之后没有改善疾病的迹象（图3O-3S）。此外，从Rm13分离出的肠球菌改善了DSS对Nod2^+/-小鼠肠炎症反应和损害（图3T、3U）。因此，表明Efm等肠球菌通过NOD2依赖的方式修复肠道损伤。

▲图3 肠球菌通过NOD2保护肠道损伤

由于SagA对Efm的生长至关重要，研究者给小鼠口服接种表达WT SagA（Lls-sagA^WT）的Lls或催化活性（C443A）SagA（Lls-sagA^C443A）的Lls来测试SagA的作用。给予Lls-sagA^WT的小鼠表现出更高的生存率，且其他疾病参数也得到改善（图4A-4E）。Lls-sagA^WT只改善了Nod2^+/-小鼠的炎症损伤（图4F-4J）。与亲本Lls和Lls-sagA^C443A培养物的上清液或无菌肉汤相比，Lls-sagA^WT培养物的上清液足以降低小鼠死亡率、疾病评分、和结肠缩短（图4K-4M），并且其作用依赖于NOD2（图4N-4P）。

与IBD组相比，在非IBD粪便标本中检测到SagA的频率和水平更高（图4Q-4S）。此外，在IBD患者中，SagA水平与REG3A浓度呈负相关（图4T）。研究者使用非IBD粪便提取物刺激的报告细胞的NOD2活性高于IBD组（图4U）。

▲图4 SagA介导NOD2修复肠道损伤

研究者将Nod2^fl/fl；LysM-Cre和Villin-Cre小鼠分别在髓系和肠上皮细胞中缺乏Nod2，接种Efm（图5A和5G）。Efm没有改善Nod2^fl/fl；LysM-Cre⁺小鼠的疾病参数（图5B-5F），而显著改善Nod2^fl/fl；Villin-Cre⁺小鼠的疾病参数，其程度与Nod2^fl/fl对照组相似（图5H-5L）。由此可见，髓系细胞中NOD2对于Efm介导的保护作用不可或缺。

▲图5 髓系细胞中的NOD2是Efm介导的保护作用所必需的

研究人员观察到，与未定植Efm的小鼠相比，无论在DSS诱导之前或之后，促炎因子IL-22在Efm定植的WT小鼠肠道外植体中均增加，但在Nod2^-/-和Nod2^fl/fl；LysM-Cre⁺小鼠没有增加（图6A和6B）。ILC3s和CD4⁺T细胞是肠道中产生IL-22的主要细胞。Efm增加了WT小鼠中产IL-22⁺的ILC3s和CD4⁺T细胞的比例和数量，但在Nod2^-/-和Nod2^fl/fl；LysM-Cre⁺小鼠中没有增加（图6C-6F）。Efm通过激活NOD2增加ILC3s的比例和数量（图6G和6H）。

来自肠髓系细胞的IL-1β可诱导ILC3s产生IL-22。此外，骨髓来源的IL-1β对微生物群的反应依赖于NOD2。Efm定植的WT、Nod2^+/-，和Nod2^fl/fl；LysM-Cre^-小鼠在第14天诱导IL-1β的分泌，IL-18没有变化（图6I和6J）。为了确认IL-22的产生需要Efm介导，研究者构建Il22ra1^fl/fl;Villin-Cre小鼠，其中肠上皮细胞中IL-22受体α亚基缺失，并证实了Efm在所有组接种后粪便中均有脱落（图6K）。与Il22ra1^fl/fl;Villin-Cre^-小鼠相比，Il22ra1^fl/fl;Villin-Cre⁺的肠道损伤并没有因Efm定植而改善（图6L-6O）。

▲图6 Efm诱导IL-1β促进产生IL-22的淋巴样细胞的增加

三个主要的NOD2变异与IBD-R702W、G908R和L1007位点的移码缺失突变（L1007fs）相关联，会导致体外多肽识别和NF-κB信号通路的丢失。R702W是最常见的变异，但尚未使用体内模型进行研究（图7A）。因此，研究者构建与人类R702W变体相同的小鼠（Q675W变体）。在没有定植Efm的Nod2^Q675W/+和Nod2^Q675W/Q675W小鼠在给予DSS后表现出适度的死亡率、体重减轻或疾病评分（图7B-7D）。Efm并没有改善Nod2^Q675W/Q675W小鼠的疾病参数，且比类似处理的Nod2^Q675W/+小鼠对DSS更敏感（图7B-7H）。此外，Efm没有诱导Nod2^Q675W/Q675W小鼠分泌IL-1β和IL-22（图7I）。因此，NOD2 R702W突变常见于IBD患者，Efm补充不能保护DSS对携带该突变小鼠造成的肠道损伤。

▲图7 NOD2 Q675W损害Efm介导的保护作用

REG3家族抗菌蛋白的丢失会损害肠道屏障的完整性。本研究证明过量REG3蛋白通过减少肠球菌等保护性物种进而有害机体健康。发作的IBD患者显示出高水平的REG3蛋白，该蛋白介导了肠道中Efm的消耗。Efm接种小鼠通过激活先天免疫受体NOD2来改善肠道炎症，由Efm分泌的DL-内肽酶SagA产生多肽刺激NOD2。Efm诱导的髓系细胞中NOD2的激活可诱导IL-1β的分泌，从而增加产生IL-22的CD4⁺ T辅助细胞和促进组织修复的先天淋巴样细胞的比例。最后，Efm不能保护携带NOD2基因变异的小鼠。研究结果表明，炎症导致的抗菌蛋白异常增高会破坏机体与肠道微生物的共生关系。总之，本研究为IBD中复杂的微生物-免疫相互作用提供了一个全面的探索，特别是REG3和NOD2通路。研究人员发现肠球菌对宿主肠道的的保护作用，并强调了由NOD2介导的关键抗炎途径，为IBD的新治疗策略的开发提供了可能。