病原体检测对于感染性疾病的病原学诊断是至关重要的，可以通过直接分离微生物或基于宿主免疫系统的间接检测来实现。临床宏基因组下一代测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）是一种新兴技术，能够全面分析来自微生物和宿主的遗传物质（DNA和RNA），解决了许多感染性疾病诊断的难题，但其仍存在许多技术挑战。

目前，mNGS已经在临床得到应用。当传统的微生物学实验难以确定感染性疾病的病因时，尤其是对于免疫缺陷相关的感染，以及新发的、罕见的、难以培养或非培养性的微生物引起的感染性疾病，mNGS发挥了重要的作用。然而，mNGS的技术困难也不容忽视，假阳性常见于湿实验过程中的污染，以及干实验中参考序列的错误和可移动遗传元件等；假阴性常见于湿实验中核酸提取困难、核酸量不足、去宿主核酸过程中去除了某些病原体核酸，以及干实验中数据库缺乏某个物种等。

因此，实验室在应用mNGS时，应建立全过程的质量控制和评估体系。质量控制包括核酸提取、建库、生物信息学分析等；质量评估包括准确性、特异性、可重复性等；性能优化验证包括检测限、稳健性和变异系数。mNGS参考物质和参考体系的开发也是迫切需要的，包括物理和数字参考物质。

mNGS与第三代mNGS在临床应用上存在各自的优缺点，mNGS通量高，但读长短，对一些耐药和毒力基因定位困难；但第三代mNGS恰恰相反，读长长，便于定位，但通量低。靶向NGS（targeted NGS，tNGS）也在临床中开始应用，相较于mNGS，tNGS降低了测序成本，但其只能检测预设靶向的微生物，使其难以进行病原体的定量或半定量，未在临床中广泛应用。

最后，作者指出，尽管有众多研究或病例报道确证了mNGS在感染性疾病中的临床应用，但仍需要一个大规模的前瞻性临床队列研究来评估临床效用和成本效益。mNGS在短期内并不会取代传统的微生物学诊断，而是作为一种补充方法，尤其在急危重症感染中。另外，应尝试扩宽mNGS的应用范围，不仅仅限于物种鉴定，比如宿主免疫应答分析、肿瘤预测、基于甲基化的组织来源预测等。

宏基因组下一代测序（mNGS）目前面临的挑战和策略（Created in BioRender.com）

该研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、北京市科技委员会项目的支持。