2024-08-19 17:20
作者 唐瑜 等
京港感染论坛
数智化赋能感染诊疗与研究
近日，同济大学附属东方医院南院检验科吴文娟团队、上海交通大学生命科学技术学院欧竑宇团队及美国康奈尔大学Joseph E. Peters团队合作研究，在国际高水平期刊《Nucleic Acids Research》（2023年影响因子16.6）在线发表了题为Transposition with Tn3-family elements occurs through interaction with the host β-sliding clamp processivity factor的研究论文，首次揭示了Tn3家族转座子介导基因水平转移，促进耐药基因传播的分子机制，为耐药防控提供了新思路。
耐药基因的广泛传播是全球公共卫生领域高度关注的问题。质粒、转座子（Transposon, Tn）、插入序列等可移动遗传元件可以介导耐药基因在不同种属、不同菌株间的水平传播，是耐药基因快速传播的重要原因。在全球形成长时间、大范围、高效率传播的耐药基因（如blaKPC、mcr、blaCTX-M等）多由Tn3家族转座子携带，但转座活动的分子机制尚未阐明。
该研究通过生物信息学分析发现，46%的Tn3家族转座酶（TnpA）具有保守的QLxxLR结构域，与结合β-sliding clamp（DnaN）的QL(S/D)LF结构域高度相似，提示TnpA可能与DnaN相互作用（图1）。DnaN，即DNA聚合酶的β亚基，是DNA复制过程中重要的活性因子，DNA双链通过在β亚基上快速滑动来完成复制。QLxxLR结构域在肠杆菌目、假单胞菌属和气单胞菌属细菌中的阳性率高达58%，在遗传进化上与特定的分支呈现明显关联，提示QLxxLR结构域是Tn3家族转座子适应进化的结果。研究以Tn3家族成员Tn4430 TnpA蛋白晶体结构为模板，利用AlphaFold2预测了12个代表性Tn3家族TnpA的蛋白结构，综合分析发现QLxxLR结构域及其空间结构临近区域的氨基酸序列均高度保守，且进化速率低，表明这一保守区域不仅具有结构特性，还通过Tn3家族转座子与DnaN相互作用，介导转座子插入正在复制的DNA。
图1 生物信息学分析显示Tn3家族转座酶具有结合DnaN的保守结构域
为了验证以上推测，作者首先以Tn1721为模型，通过Pulldown、Far-western blot、生物膜干涉实验、酵母双杂交多种实验验证TnpA可与DnaN直接作用，并证实这一相互作用依赖于QLxxLR结构域的氨基酸位点（图2）。
图2 TnpA可与DnaN发生相互作用
进一步，研究利用定点突变及mating-out转座实验评估QLxxLR结构域在Tn1721转座活动中的作用，发现Q54、L55和R59三个位点对于Tn1721转座活动至关重要。通过TnpA补充表达实验还发现，TnpA二聚体中仅需一个单体即可与DnaN相互作用（图3）。
图3 mating-out转座实验显示QLxxLR结构域对Tn1721转座活动至关重要
为了评估转座子靶位的整体偏好性（偏好插入质粒或染色体），作者通过自主设计的mating-in转座实验发现，91%转座活动均插入到质粒上，复制起始点和启动子区域是插入热点，而染色体上的转座插入均发生在DNA复制终点。以上结果表明，Tn1721对质粒和染色体DNA复制终点表现出明显的偏好性。
图4 Tn1721偏好插入质粒和染色体DNA复制终点
综上，该研究首次证实了Tn3家族转座子通过与宿主菌DnaN相互作用介导基因插入DNA复制体，质粒是Tn3家族转座插入活动偏好的靶位。临床菌株中，多种可移动遗传元件采用这一策略完成完成基因偏好性插入活动，说明DnaN在众多耐药基因水平传播中发挥了重要作用，可成为控制耐药基因的水平传播的新靶点。
同济大学附属东方医院南院检验科唐瑜博士、华山医院抗生素研究所张剑峰博士和上海交通大学生命科学技术学院博士研究生关家浩为论文共同第一作者，美国康奈尔大学Joseph E. Peters教授、上海交通大学生命科学技术学院欧竑宇教授、同济大学附属东方医院南院检验科吴文娟教授和唐瑜博士为论文共同通讯作者。该项目受国家自然科学基金、上海市青年科技英才扬帆计划和东方医院青年引进人才项目的支持。
原文链接：
https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkae674/7730536
第一作者/通讯作者：唐瑜
医学博士，同济大学附属东方医院南院检验科，主管技师。担任上海市微生物学会耐药防控专业委员会委员，中国健康促进基金会感染性疾病微生物检验学术交流公益项目专家委员会委员。主要研究方向为细菌耐药的传播机制。2017-2018年于美国康奈尔大学从事访问学者研究工作。主持国家自然科学基金青年项目，入选上海市青年科技英才扬帆计划。以第一作者/通讯作者发表SCI论文13篇，研究成果发表于Nucleic Acids Research、Emerging Microbes & Infections、Journal of Antimicrobial Chemotherapy、Antimicrobial Agents Chemotherapy等国际专业SCI期刊。
第一作者：张剑峰
生物学博士，毕业于上海交通大学生命科学技术学院。2023年至今进入复旦大学附属华山医院抗生素研究所博士后流动站，获得了中国博士后科学基金面上资助和国家资助博士后研究人员计划的资助。主要研究方向是微生物互作机制和细菌耐药机制，以并列第一作者在Genome Medicine等期刊上发表SCI文章4篇。
第一作者：关家浩
上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室2022级博士生，导师：欧竑宇教授。专业：生物学。主要研究方向：细菌毒素-抗毒素系统的精准识别与功能研究。以第一作者或共同第一作者发表文章3篇，授权软件著作权2项。
通讯作者：吴文娟
博士、同济大学教授、博士生导师，同济大学附属东方医院南院检验科主任。中国女医师协会五洲女子科技奖获得者、国家卫生健康委药敏标准委员会专家、中国合格评定委员会主任评审员、全国卫生系统新冠肺炎疫情防控先进个人、上海市公共卫生三年行动计划重点学科负责人、上海市卫健委优秀学科带头人、上海市科委学术技术带头人。研究方向：病原微生物快速检测及耐药机制研究、医院感染控制等。主持国家科技重大专项课题2项、国家自然科学基金4项、省市级课题和人才计划20余项，发表论文140余篇，编写行业标准、专著10余项，申请发明专利8项。
通讯作者：欧竑宇
上海交通大学微生物学长聘教授，生命科学技术学院/微生物代谢国家重点实验室PI，博士生导师。采用基因组学、生物信息学和分子遗传学等实验和计算方法，开展肺炎克雷伯菌等革兰阴性病原菌耐药传播的工作，专注于耐药移动元件的复杂结构和转移机制研究，发展了一系列移动元件的开放数据库和软件工具。迄今以第一或通讯作者在Nucleic Acids Research (15篇)、Genome Medicine、Briefings in Bioinformatics、Emerging Microbes & Infections和Research等国际刊物发表论文六十余篇。先后主持十余项国家和省部级项目；曾获教育部“新世纪优秀人才”、上海市“青年科技启明星”和美国康奈尔大学“唐氏中国学者”等项目支持。
通讯作者：Joseph E. Peters
康奈尔大学终身教授、博士生导师，康奈尔大学微生物系系主任。长期致力于研究DNA复制、重组和损伤修复机制，细菌基因组进化及可移动DNA的活动机制，尤其专注于Tn7和CRISPR-Cas转座系统。研究成果先后发表在Cell、Science、Molecular Cell、PNAS、Nucleic Acids Research等顶级期刊，先后主持NSF、NIH科研项目十余项。
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作者｜唐瑜（同济大学附属东方医院南院）
审校｜谢轶（四川大学华西医院）