2024-09-18 17:20
作者 成莉
京港感染论坛
数智化赋能感染诊疗与研究
近年来，随着医疗技术的革新（如器官移植）和免疫抑制剂的使用，导致免疫功能受损的病人不断增加，加上广谱抗菌药物的不合理使用，导致真菌感染的病人不断增多，其中新型隐球菌感染也呈现出上升趋势。回顾我院一例新型隐球菌肺部感染病例，分享该病例隐球菌的发现与分离培养过程。
▼ 一、病情介绍
患者1月前无明显诱因出现咳嗽、咳痰，咳白色泡沫痰，就诊当地社区医院，给予输液对症支持治疗病情较前好转，4天前患者受凉后再次出现咳嗽咳痰，咳黄色粘痰，量少，不易咳出，伴心累、气促明显，夜间高枕卧位，走平路时感心累明显，休息可稍缓解，就诊于当地中医院，诊断“慢性阻塞性肺疾病伴急性下呼吸道感染”给予抗感染等对症支持治疗后症状稍好转。2天前患者心累加重，稍活动即感心累不适，伴双下肢轻度浮肿，伴上腹部疼痛不适，于2024年4月15日以“慢性阻塞性肺疾病件急性下呼吸道感染”收入我院呼吸科。
既往史:患者4年前因心累于我院行“心脏瓣膜置换术”。
▼ 二、实验室检查
2024年4月15日WBC 12.56×10^9/L、中性粒百分比87.6 %、PCT 0.280 ng/ml、TNT157ng/L，BNP>35000pg/ml。
2024年4月17日 WBC 11.52×10^9/L、中性粒百分比85.8%、BNP15479pg/ml、CRP 12mg/L。
2024年4月21日 WBC 7.34×10^9/L、中性粒百分比66.7 %、BNP8692pg/ml。
2024年5月15日 WBC 6.49×10^9/L。
▼ 三、微生物学检查
2024年4月15日，痰培养及涂片，涂片见中量酵母样真菌孢子（有出芽）及假菌丝，少见周围有明显淡染区的真菌孢子。
▼ 四、隐球菌的发现及分离过程
该病人为老年患者，入院诊断为慢性阻塞性肺疾病伴急性下呼吸道感染，于是行痰培养并涂片。痰涂片革兰染色见中量酵母样真菌孢子（有出芽）及假菌丝，少量周围有明显淡染区真菌孢子（图1、2），油镜下该孢子较其他酵母样孢子菌体大、圆，有的呈葫芦状。结合菌体及其周围淡染区的特点，考虑该真菌孢子可能为隐球菌，淡染区可能是未着色的荚膜。于是用10%KOH消化痰液离心取沉淀后行墨汁染色，墨汁染色见厚荚膜真菌孢子（图3）。为了进一步验证其是否为隐球菌，取该病人的血液做隐球菌荚膜抗原试验，结果为阳性。于是加种了沙氏培养基，培养2天后，培养基长出大量奶油样菌落（图4）。由于该标本在涂片时除发现隐球菌外，还存在其他酵母菌，且其他酵母菌生长较快，因此，从沙氏培养基上分离出隐球菌的单个菌落成了一个难题。
于是总结隐球菌与其他酵母菌的不同点主要有：第一，隐球菌生长较慢，培养2~5天后菌落呈白色至奶油色、黏稠、不透明，而临床上其他常见酵母菌生长较隐球菌快（光滑念珠菌除外），菌落奶油色，但不粘稠；第二，隐球菌脲酶阳性；第三，在念珠菌显色平板上，隐球菌最初呈无色黏液或者奶油状，培养时间延长会出现淡紫色，而常见的其他酵母菌在显色平板上会呈现其特殊的颜色，如翠绿色、铁蓝色；第四，通过革兰染色观察镜下形态。
综合上述特点及该标本涂片看到中量酵母样真菌孢子及假菌丝，我们可猜测光滑念珠菌（光滑念珠菌无假菌丝，且在显色平板上与隐球菌不易区分）的可能性不大，因此可行科玛嘉显色平板进行颜色鉴别。由于沙氏培养基上的菌落均呈白色奶油状，因此在沙氏培养基上挑取相对较小，较黏稠的菌落转种科玛嘉显色平板，并同时用同一菌落做脲酶试验。孵育4h后，脲酶阳性（图5），证实我们挑取的菌落中含有隐球菌。48h后观察科玛嘉显色平板上有大量翠绿色菌落及几颗较小的白色菌落（图6）。挑取科玛嘉平板上的单个白色菌落质谱鉴定并分离纯培养并做药敏试验。经质谱鉴定白色菌落为新型隐球菌，翠绿色菌落为白色念珠菌。
▲图1
▲图2
▲图3
▲图4
▲图5
▲图6
▼ 五、病人诊疗过程
该病人入院诊断为慢性阻塞性肺疾病伴急性下呼吸道感染并伴有心累，于2024年4月15日行痰培养、痰涂片及心脏相关检查。痰涂片查见厚荚膜真菌孢子，结合隐球菌荚膜抗原的结果，联系医生并询问其是否有鸽子接触史，病人告知无鸽子接触史，建议行肺部CT检查。由于心脏检查结果显示TNT157ng/L，BNP>35000pg/ml,考虑到该病人既往有心脏相关疾病，目前心累且心肌标志物结果较高，于是转入心脏外科进行治疗。4月21日病人心累症状好转，自行要求出院。出院时，医生告知休息一段时间后于呼吸门诊治疗隐球菌感染问题。2024年5月15日，病人就诊于呼吸科门诊给与氟康唑治疗。
▼ 六、经验与体会
隐球菌广泛存在自然界，如土壤、鸽粪、桉树等中，鸽粪的含量高[1]。患者因吸入空气中的隐球菌孢子而感染,但是有明确的鸽子接触史并不多见[2]。引起人类致病的主要是新型隐球菌和格特隐球菌。根据流行病学调查，新型隐球菌主要感染免疫力低下或缺陷的人群，而格特隐球菌可发生在免疫力正常的人群之中，且病死率高于新型隐球菌。新型隐球菌最主要的致病物质是其菌体外层宽厚的多糖荚膜上含有毒力因子—葡糖醛木苷甘露聚糖[3]，多糖荚膜在抵抗机体免疫反应中发挥重要作用，能够逃避宿主细胞的清除[4]。
新型隐球菌的感染多由呼吸道吸入，引起肺部感染，可为一过性，也可引起严重的肺部感染[5]。新型隐球菌的肺部感染多为隐匿，可有发热、咳嗽、咳痰、气短、胸痛等症状，亦可无症状。胸片常见肺局限性小斑片影，常误诊为肺结核或非典型病原体肺炎。由于其具有嗜神经性，约有80%的隐球菌最终由肺经血液播散至中枢神经系统，引起隐球菌性脑膜炎，患者主要表现为头痛，或者颅内压升高引起恶心、呕吐、烦躁和性格改变等症状，严重时病变累及脑实质，危及生命，因此隐球菌的早期诊断非常重要，特别是免疫力低下的病人。
隐球菌病的治疗药物主要有氟胞嘧啶（5-FC）、两性霉素 B 及其脂质体及三唑类抗真菌药物，其中 5-FC 为最早发现可以治疗隐球菌病的药物，但容易对其产生耐药性；两性霉素 B对大多数真菌有效，但有肾毒性；氟康唑为目前首选治疗药物，对严重病例可考虑 AmB 联合氟康唑使用[6]。
隐球菌感染的诊断方法很多，包括血清学、病原学、影像学和分子生物学等。影像学检测容易与其他疾病混淆。基因测序NGS的灵敏度和特异度高，但由于成本高，不适合常规检查。墨汁染色方便快捷，主要适用于脑脊液。培养是诊断隐球菌的金标准，但耗时长，且要求培养基中隐球菌量多，不被其他生长较快的细菌或者真菌覆盖。痰涂片染色对痰液质量要求高，容易被误检、漏检，且要求实验室人员具备丰富的经验和强烈的责任心。隐球菌荚膜抗原可作为补充试验，但大多是在临床医生怀疑时才检查。
临床上引起肺部感染的病原体主要为病毒和细菌，隐球菌引起的肺部感染较少见。在此病例中，该病人虽没有明显接触史，但为老年患者，患有多种疾病，免疫力低下，属于易感人群。由于病人入院前后未行肺部影像学检查，且没有接触史，因此很容易被忽略隐球菌的感染。对于实验室检查，标本的质量是关键，此病人痰液标本合格，涂片染色发现可疑病原体，通过消化后墨汁染色和隐球菌荚膜抗原试验印证，利用隐球菌与其他真菌的区别，成功分离培养出隐球菌，让病人得到了早诊断早治疗，及早预防中枢神经的感染。
通过此病例告诉我们：由于临床上存在很多苛养、厌氧、生长缓慢等难培养的微生物，普通的培养基很难满足所有微生物，因此，涂片作为微生物检查最直观、快速、省钱的检查手段，可以让我们发现很多涂片看到了而培养基上难生长的微生物。此时，我们可以通过镜下特点，思考补救方法，如延长培养、使用特殊培养基或PCR等方法，减少单纯培养存在的一些漏检问题，为临床治疗提供更多的帮助。同时，也告诉我们在临床工作中，要善于发现、思考并总结经验，认真对待每一位病人和每一份标本。
参考文献（上下滑动）
[1]刘宏伟,李世豪,朱奕,等.新型隐球菌感染导致肾上腺皮质功能减退症1例报告并文献复习[J].陆军军医大学学报,2023,45(09):989-993.DOI:10.16016/j.2097-0927.202211158.
[2]成英,薛青,邓新宇,等.12例新型隐球菌肺炎诊治临床分析[J].中外医学研究,2016,14(24):113-115.DOI:10.14033/j.cnki.cfmr.2016.24.064.
[3]单琨,左惠芬,郑翠影,等.播散性隐球菌病1例分析[J].中国热带医学,2022,22(11):1043-1046.DOI:10.13604/j.cnki.46-1064/r.2022.11.08.
[4]宋英,邱玉芳,刘惟优,等.隐球菌致病的免疫学机制研究进展[J].赣南医学院学报,2019,39(04):417-421.
[5]王芳,黄琛,杜艳,等.36例新型隐球菌性脑膜炎的临床分析[J].中国抗生素杂志,2019,44(02):273-276.DOI:10.13461/j.cnki.cja.006566.
[6]贺婷. 新型隐球菌感染临床分布及其特征分析[D].重庆医科大学,2014.
成莉
就职于乐山市人民医院，主管检验技师，主要从事临床微生物检验工作。2021年6月至2021年12月在解放军总医院第一医学中心进修，参与国家青年课题1项，具有较丰富的临床经验。
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作者｜成莉（乐山市人民医院）
审校｜王占伟（北京大学人民医院）