为克服传统筛选策略依赖已知抗原的局限性，研究团队创新性地采用“与抗原无关”的筛选策略，从ST147感染康复患者的记忆B细胞中富集抗体。通过全细胞ELISA初筛获得214个阳性单克隆抗体后，研究团队进一步通过分子克隆与功能验证，从中筛选出134个能够成功配对且特异性结合肺炎克雷伯菌的单克隆抗体。随后利用新型高通量发光杀菌技术进行功能性筛选，最终鉴定出20个具有稳定补体依赖性杀菌活性的候选单克隆抗体（图1b）。深入的结合谱分析（图1c）与抗原生化验证（图1d）揭示，这些抗体清晰地分为两大功能类别：第一簇抗体精准靶向KL64荚膜多糖，而第二簇抗体则特异性识别O2a-O抗原。

图1 针对ST147NDM-1暴发菌株的特异性单克隆抗体的分离、筛选与结合表征

在获得两类高活性抗体后，研究进一步探究其潜在的保护机制。结果显示，KL64荚膜抗体的保护作用通过多重免疫效应协同实现：在体外吞噬实验中，该抗体在>0.6 μg/ml剂量下可显著增强巨噬细胞的吞噬清除能力（图2b），而所有O抗原抗体均未表现此活性，表明O抗原抗体在调动先天免疫方面存在局限（图2c）；更重要的是，活细胞成像发现KL64荚膜抗体在亚杀菌浓度下可诱导细菌呈链式生长（图2d），这种生长方式通过限制细菌在组织中扩散，为免疫系统清除病原体争取了时间。

图2 靶向ST147NDM-1的杀菌性单克隆抗体体外功能特性研究

体外活性与功能并不能完全代表体内的真实疗效，研究需在动物模型中进行最终验证。在小鼠模型中，KL64荚膜抗体08O09展现出卓越的体内保护效力。感染前24小时预防性给药可使小鼠存活率从<20%提升至40-60%，感染后1小时治疗性给药同样能显著延长小鼠生存时间，脾脏细菌负荷下降2–3 log₁₀（图3a,d,e）。与之形成鲜明对比的是，尽管O抗原抗体05D08和05N02在体外显示出最优的杀菌活性（图2a），但在所有体内实验中均未显示保护作用（图3b-d）。总之，对于高荚膜化的耐药肺炎克雷伯菌，单纯的体外杀菌活性不能可靠预测其在复杂生理环境中的保护效力。

图3 08O09、05D08和05N02单抗对携带KL64耐药菌株的体内预防效力评估

研究者进一步验证08O09抗体对不同临床分离株的广谱保护潜力。结果显示，KL64靶向抗体08O09对多种耐药肺炎克雷伯菌株均表现出显著保护效果。流式细胞术表明，08O09能与遗传背景不同的KL64菌株有效结合，证明其识别表位具有保守性（图4a）。功能实验进一步表明，虽然对异源菌株失去直接杀菌活性，但抗体的核心保护机制——调理吞噬和诱导细菌呈链式生长的功能完全保留（图4b-e）。动物实验同样证实，预防性给予08O09抗体能显著提高异源菌株感染小鼠的存活率，并使脾脏细菌负荷下降4.7-5.2 log₁₀（图4f,g）。综上，KL64靶向策略凭借其保守表位和得以保留的核心功能机制，为应对多样化耐药菌的进化提供了具有广谱潜力的免疫治疗方案。

图4 KL64靶向抗体08O09的广谱保护效力与机制

本研究首次证明，针对泛耐药性CRKP，尤其是ST147型菌株，靶向KL64荚膜的人源单克隆抗体在体内能够显著提高小鼠存活率并降低细菌负荷，显示出超越体外杀菌活性的保护作用。除对细菌的直接作用外，该抗体还通过增强巨噬细胞吞噬能力、限制菌体扩散以及调动宿主免疫反应等多种方式发挥作用，为耐药菌感染的防治提供新的策略与思路。此外，本研究采用的“与抗原无关”的筛选策略结合高通量功能验证，为快速获得针对耐药病原体的有效单抗提供了可参考的开发路线。

作者｜赵佳凤（河北医科大学第二医院）

审校｜谢轶（四川大学华西医院）