在广东省发生的第五波H7N9禽流感疫情背景下，我们报道一例来自广东清远的人感染H7N9禽流感病毒致死性病例，该病毒在血凝酶切割位点携带了多碱基氨基酸插入，推测这种病毒可成为高致病性禽流感病毒。我们对此禽流感患者的临床、流行病学和病毒学方面的资料进行了总结，发现在临床病程方面，本例患者与之前人感染H7N9禽流感病毒未显示出明显的差异，没有临床和病毒学的证据显示在呼吸道以外有病毒的扩散。这提示H7N9现在可能发生了与高致病性有关的基因突变，产生了对禽类高致病性，但对人未显示出明显增强的致病力。

患者是一位来自广东省连州市的56岁男性，既往有糖尿病和高血压病史。患者在居所后院饲养鸡，在发病数周前这些鸡有死亡的情况，其中部分病死鸡被患者及其家人食用。

2017年1月7日（发病第1天）患者出现发热伴有咳嗽，随后出现气短。患者于1月10日（发病第4天）在当地医院就诊（图1），根据临床体征和CT检查，诊断双侧肺炎，取患者的咽拭子行流感病毒A/B床旁检验显示阴性，但因患者有禽类接触史，开始给予奥司他韦（75mg bid）治疗。在起病第6天，患者临床状况明显恶化，进展至严重呼吸衰竭，低氧血症（血氧饱和度78.6%）及昏迷，随后患者被转入重症监护室并行机械通气治，此时患者气管内抽吸物测H7N9病毒（实时定量逆转录PCR）显示阳性。起病第7天，患者心跳骤停，当天亦有轻微的胃肠道出血（但未行内镜检查），经过心肺复苏术和静脉注射去甲肾上腺，患者心跳恢复，胸片提示双肺浸润伴肺门阴影（图2 A），心脏大小和形态正常。因患者进展至严重急性呼吸窘迫综合征，停用奥司他韦，改用帕拉米韦（0.6GM i.v. qd），并开始使用抗菌素和体外膜肺氧合（ECMO），在使用ECMO治疗期间，患者氧合指数维持在200mmHg左右(图3)，然而，在脱离ECMO治疗后，患者的临床状况持续恶化。生化检测结果显示在住院过程中，患者的白细胞总数、中性粒细胞计数、降钙素原、谷草转氨酶、肌酐、乳酸脱氢酶、尿素氮、D-二聚体增高，血红蛋白水平持续低下。因肾功能恶化（起病第8天至14天），患者开始接受持续肾脏替代治疗。气管内抽吸物病毒载量从第16天开始下降，在第20天转阴（图3）。住院期间，患者继发了多重耐药菌铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌感染，同时在第11天血清中检测出巨细胞病毒（CMV）DNA。对于继发细菌感染，治疗上采用联合使用抗菌素方案，而对于继发CMV感染，在第32天开始使用更昔洛韦治疗。在第30天行肺部CT检查示多发双肺斑片状高密度病变，双侧胸腔积液（图2C）。同一天脑部CT扫描显示在左侧放射冠和右侧中心半卵圆边界不清低密度病变，最大约8mm×10mm，CT值为8 Hounsfield，提示腔隙性梗塞。双侧大脑半球对称，灰白质分明，脑实质未见明显病变，沟回无加深或增宽，脑室无扩张或畸形（图2 D）。反复行心电图检查未提示有心肌炎且多普勒心脏彩超提示心肌收缩功能良好。第40天，胸片仍提示双肺浸润伴肺门阴影（图2 B）。患者在第43天，患者因严重肺炎、急性呼吸窘迫综合征和多器官衰竭，最终死亡。

对于病毒学，我们采取动态监测的方法。起病后第17天，在气管内抽吸物中H7N9病毒RNA仍持续在较高水平（＞4 log RNA拷贝每毫升）（图3）。在整个疾病过程中，血清始终未检出病毒RNA，在起病第11天曾一过性地在粪便中检出病毒核酸。血清标本H7N9病毒血凝抑制抗体检出阳性，第8天血凝抑制抗体滴度为1:80，在第29天升至1:640（图3）。

病毒进化分析结果提示QY/17（“A/Qingyuan/GIRD01//2017 (QY/17)”）的HA节段与之前研究发表的H7N9的W2-C株相关。 QY/17血凝酶切割位点在碱性氨基酸残基上有插入(PEVPKRKRTAR/GL)，提示病毒可能对鸡呈高致病性。类似的突变也分别在广东省(A/Guangdong/175SF003/2016)和台湾省(A/Taiwan/1/2007)人分离株的病毒基因序列中发现。与其他A/H7N9相比，这三个病毒的HA序列在系统进化树中存在聚类。广东一份环境标本H7N9病毒HA序列与之类似，不同的是，其在切割位点第6位上无G到R的突变，该病毒与另两份来自人体的病毒在系统进化树上聚类。与其他H7N9病毒一样，该病毒HA基因存在Q226L氨基酸替换，而已知这种替换能增强病毒对哺乳动物α2-6唾液酸受体的结合能力。QY/17、A/Guangdong/15SF010/2015(H7N9) 和A/environment/Guangdong/C16283222/2016病毒株的NA基因相聚类，而A/Taiwan/1/2007在进化上是分开的，提示来自台湾该株病毒的NA来源不同。QY/17病毒株NA基因存在与奥司他韦耐药相关的突变（R292K）。至监测到病毒耐药时，患者已经服用了4天的奥司他韦，A/Guangdong/17SF003/2016 和 A/Taiwan/1/2017都存在与奥司他韦耐药有关的R/292/K突变，但是来自广东环境标本的病毒则无。与其他H7N9病毒一样，QY/17在M基因上有与金刚烷胺耐药相关的S31N突变。作为哺乳动物适应的关键标记，PB2的E627K在该病毒中存在。三株病毒的PB1基因片段非单源进化，来自遗传学上不同的H7N9病毒的重组。 

1）第五波人H7N9流行以来，广东和台湾也分别报道了一例类似血凝酶切割位点多个碱性氨基酸插入的H7N9病毒分离株。这些新现病毒的HA抗原与其他H7N9病毒及另一份来自广东的环境标本存在聚类，两者在切割位点上有类似的一个氨基酸的差别，提示在广东地区高致病性H7N9亚系可能已持续出现。

2）本例患者临床表现与之前人感染低致病性禽流感病毒未显示出差别。尽管病毒在呼吸道中持续且高水平复制，但在血清中病毒RNA却未被检出。虽然患者血清肌酐和血尿素氮升高，提示中度肾功能损害，谷草转氨酶中度升高，提示中度肝损害，这些在之前在其他H7N9患者中也曾出现类似表现。因此，没有证据表明该突变病毒有系统性的扩散，该病毒的突变对人也没呈现高致病性。

3）该病毒的R292K突变使病毒对奥司他韦和帕拉米韦均出现耐药。在使用抗病毒药物奥司他韦和帕拉米韦10天后，患者气管内抽吸物病毒滴度仍然维持高水平，推测在这例患者中病毒复制失控及抗病毒药物耐药的出现可能促进了不良的临床结局。

4）与患者密切接触的家人及卫生护理人员均未发病，因此无证据表明病毒出现人传人的适应变化，也提示了血凝酶切割位点突变虽然使禽流感病毒成为高致病性，但未必就必然增加病毒人际传播能力。

5）与低致病性禽流感病毒局限于呼吸道和消化道不同，在鸡体内高致病性禽流感病毒为系统性扩散到包括肌肉在内的多个器官，而且病毒滴度更高。因此在抓持或宰杀被感染的禽类或者食用未煮熟的禽肉时，高致病性病毒人畜传播风险很可能会增高。

6）在中国，对于严重呼吸疾病的患者和禽类加强监测尤为重要，特别应关注多碱基切割位点突变扩散范围及奥司他韦耐药的证据。

     感谢在患者救治过程中，工作在一线的重症监护科ICU和呼吸内科的医生和护士；感谢在本研究中付出了智慧和辛勤劳动的科研工作者。

本文通信员：杨子峰  Email: jeffyah@163.com

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