清华大学附属垂杨柳医院  宁永忠

武汉新冠王这个话题，我竟然能够写到第五篇，确实超乎一开始我的所料。之前拙笔，见医促会微感分会和京港感染论坛公众号： 

这一篇是第五篇。说一个技术问题。一开始，12月底，面对新的病原体，最先检出的方法NGS是（下一代测序）。可以说，这一次疫情，NGS功莫大焉。不过后续所有患者都做NGS，不现实。所以确定核酸序列之后，自然是靶向PCR为主。

 而PCR方法检测新冠王，不时有提出假阴性高的问题。甚至有观点，需要“CT代替核酸”！！笔者不学，拟分析如下。各位一笑！非专业人员（非专）也可以一读。

先解释名词

核酸

这是遗传学概念。是生物学特征的遗传载体。简单说，孩子为什么像妈妈？是因为妈妈把核酸（通过受精卵）传给了孩子。核酸的发现，把整个生物学打通了（以前，动物是动物，植物是植物……各不相同）。所以，发现了核酸的秘密（1958年发现双螺旋、1962年解码密码子），是生物学领域的翻天覆地的大事件。这一次查病毒，首先是测核酸。未来可以测抗原、抗体、产物、毒素、病毒整体……但现在都是查核酸。

PCR

是聚合酶链反应。是把少量核酸（检测不到，或很难检测到）扩增到可以检测的过程。通过扩增的循环数，或扩增后测序、荧光探针等，判断结果。这种方法的生物学特异性（引物特异性结合）、生物学敏感性（方法学本身是扩增过程，相当于戏精可以自我加戏），都很好。这个技术的发明是八十年代的故事——一个传奇。

NGS

是下一代测序。不同于经典的靶向PCR的一种技术。各位非专如果想了解，百度“二代测序”“下一代测序”“NGS”“next generation sequencing”都可以，这里不展开了。这个技术商业化没有几年，但表现卓异，前途光明。我相信这是微生物学领域的革命性技术，值得期待。

好，下面解释核酸检测阳性率（规范说法是敏感性，我后面解释。这里适应大家阅读，先说阳性率）没有想象的高的可能原因。

1.窗口期

这是专业名词。非专可以理解为，检测目标客观上不能被某种方法、某种试剂盒检测到。不是人员主观、行为原因。比如查抗体。患者还没有产生抗体，或者抗体浓度太低——这个时段，一般方法检测不到。那这个时段，就是窗口期。

核酸一样。浓度太低，不容易检测到。PCR虽然可以扩增，但对起点浓度也有一定要求。低于起点浓度，则阳性率比较低。

2.病期/病程

上一条说检测对象浓度高低，是微观概念。注意浓度高，不一定发病。当然二者很多情况是一致的。

发病和过程是宏观概念。症状不典型时，阳性率容易低。而症状典型，传染性更强，阳性率更高。

3.患者当时的状态

比如刚刚咳嗽之后。粘膜分泌物多。

这一条一定小心。刚刚咳嗽之后，传染性强。因为此时患者周围有大量飞沫、气溶胶！！！

4.标本部位、种类

大的角度，新冠王肺炎患者血液标本阳性率显然比呼吸道标本低得多。柳叶刀第一批文章报过，RNA血症概率15%。初期是重症多。目前估计不到10%。轻症应该远低于1%。具体多少，等待研究数据。

而呼吸道标本，肺炎患者：肺组织（金标本）>BALF>抽吸痰或咳痰>鼻咽拭子或口咽拭子>鼻拭子。所以王辉教授建议不做鼻拭子。

单纯的上呼吸道感染：病毒有一个从外到内的过程。上呼吸道标本阳性率高。一般不会采集深部标本。

BALF是支气管肺泡灌洗液。非专可以理解为，向局部肺段注入生理盐水，再抽出来。这个过程叫“灌洗（灌进去，洗一洗）”，抽出来的液体是支气管肺泡灌洗液，缩写BALF。

选择什么标本，主动权在医师手里。这一条大家一定要明确！！！

新冠王肺炎干咳无痰（太像SARS了），所以理论上推测，可以用大气道的洗液。大家有实际操作可以反馈给我。还没有见到经验或文献。

（引自华西医院实验医学科王旻晋老师文章《新冠病毒肺炎实验室检测的华西体会——分析质量篇》）

5.采样

比如鼻咽拭子，采集时一定要到位，并在局部停留几秒，时间可以长一点。吸足分泌物。采的标本多，则阳性率高。部位太浅、时间太短，则阳性率低。

标本的选择、采样效果，是对结果最有影响的因素之一。

6.核酸提取

7.扩增有影响

8.结果判读

这三个取决于试剂盒。个人观点，目前的试剂盒推出的略急，评估可能不充分。美国试剂盒刚刚上市，后续同时进行评估。

核酸提取，就是让核酸脱离原始标本载体，成为比较纯的状态——有业内专家认为，也是对结果最有影响的因素之一。

扩增取决于仪器、方法学参数等。

结果判读：如结果信号的原理、实际采集、阈值、人员判断的主观因素等。

9.人员经验，敬业，不慌张

这一条有一定影响，甚至有时候影响很大。取样不足，提取核酸，实验过程……都涉及。

一方面是一线都缺人，不除外新人临时上岗。一方面是防护服的不舒服。一方面是连续工作的疲劳（尤其是武汉的各位亲）。一方面对病毒、疾病的未知导致恐惧。一方面是比较强的传染性，对自己、同事、家人有威胁，会不寒而栗。这些都会导致操作变形、判断失误。

10.不同于PCR的方法

当然现在做NGS的依然不多。不过选择PCR还是NGS也有结果不同，这自然是方法、技术的选择影响。类似于经济学的机会成本。

其他方法，最值得期待的是抗原、抗体等。已经有试剂盒，还在路上……，大家等待！

因为有诸多影响（上面就有十来个），所以会有不符合的情况——就是实验室结果和临床表现不对应的现象——这比较常见，并不奇怪。别的传染病、别的疾病，都有。有经验而理性的医师，都会客观接受这样的现象——因为没有人能够完全改变。

标本角度，大量的标本只是咽拭子。很多患者都做BALF，这不现实。我个人非常尊重这个现实，但建议大家分析的时候，一定要全面、合规、条分缕析。知道了正确的方式，或最优的方式，知道了谁有主动权，才是问题的关键。

试剂盒角度，我相信未来的试剂盒会更好一些。大家（包括非专）可以关注、促进新试剂盒研发，多个PCR试剂盒进行比较，甚至纳入NGS等不同的技术等。而复核时，同一试剂盒复查，我个人觉得不太好。不同试剂盒复查，可能更好一点——个人观点，期待拍砖。

临床理念角度，感染性疾病的确诊靠的是（基于临床的）微生物学———这是西医临床基本规则。所以才会有“临床微生物学是感染性疾病诊断的金标准”这样的说法。这不是我们从业人员的主观夸大。而是感染性疾病内在特点决定的学科必然、逻辑基础。所以就感染性疾病而言，微生物学和临床表现、影像学等的地位是不平等的，比二者高。这一条大家知晓。这应该是专业人员的常识。所以特别期待，专业人员的讨论不要再出“CT代替核酸”的笑话。或者如“终于，不用等核酸检测就可以确诊了！”这样振振有词的啼笑皆非。

引申一下。第五版诊疗方案中，诊断标准做了地域划分。武汉自己的诊断标准多了“临床诊断”这一层，指的是特征性的影像学表现。大家注意，这不是“CT代替核酸”，看一下确诊标准内容就知道了。分层诊断是西医疾病诊断的普遍规律。而把特征性影像学表现置于低于确诊标准的下一个层面，恰恰是感染性疾病基本规则的必然。

这对于非专可能没有什么。对于专业人员，大家要谨慎、明晰。不要犯原则性错误。

方法学角度：敏感性和阳性率。

这是本科层面的概念，是物理、化学、生物学等都有的概念。阳性率是一群人（无论有病、无病），某种方法/试剂盒检测的阳性百分比。

敏感性是对确诊患者，某种方法/试剂盒检测的阳性百分比。两个概念一比较就知道，阳性率的分母不确定（无病的范围、数量太大了），所以在方法学角度，敏感性比阳性率要严谨。当然敏感性是理论概念，现实应用时对具体患者的价值有限。

大家表达时，慎用阳性率。合理应用敏感性。——这会逗露专业人员的流行病学水平。就像死亡率、病死率一样。

另外一个特别无奈的话题是，确诊患者转阴性后再转阳。这在肝炎领域、HIV领域似乎不是新话题。但新冠王角度，还没有正式的文献报道。我以前讨论涉及到这一点。近期看到也有同道提及，甚至说是实例。分析而言，

1.生物学原因。病毒变异了——RNA病毒，变异不奇怪。新病原适应人体，变异也不奇怪。

2.检测原因。采样、实验室操作、试剂盒原因，导致中间的阴性，可能是假阴性。

3.治疗原因。某种药物将病毒压制到低浓度，导致检测阴性。不再用药（甚至出院），没有压制，病毒复活了。浓度升高，导致症状，甚至传染性。这在细菌学领域屡见不鲜。病毒学领域，乙肝也有类似。

4.病程原因。是不同的病程，患者没有产生有效抗体，又一次发生了感染。这一条需要证据证实。

如果真有这样的实例，意味着，

1.临床要小心。目前的出院标准可能需要完善。长期预后需要进一步的观察、积累数据。

2.需要尽快确定原因。

2a如果是中间假阴性导致，那需要换技术、换试剂盒、换人。

2b如果是生物学原因，那需要技术攻关，增加检测覆盖性。

2c如果是治疗原因，则需要新药——在还没有有效根除的老药的情况下！！！

2d这一条如果证实有，那出院了也要防护好。

特别希望，这不是真实的现象——是谣言！

新病原，诸多未知。仓促应战，身心疲惫。急就章，挂一漏万。大家多批评，随时反馈！

坚信我们一定会战胜疫情，取得完胜！

向湖北一线的各位亲，敬礼！

向全国的医务同道，敬礼！

向所有遭受煎熬、甚至经历病痛、非遇的各位非专，敬礼！

我们同在！！！

供稿：宁永忠

审稿：鲁炳怀