作者：邓卫宁、吕文艳、张琳（西安医学院附属宝鸡医院医学检验科）

审校：宁永忠（清华大学附属垂杨柳医院检验科）

随着新冠王在国内的逐渐落幕，各项工作全面步入正轨，细数自己的工作日常，分享一例犬小孢子菌（Microsporum canis）的鉴定过程及体会，方便大家共同交流和学习。

故事回到2019年年底，又是一个平常的下午。坐在显微镜前阅片，实习生小程突然找我给他看看胳膊。拉起衣袖的瞬间，只见左右胳膊都有环状红斑，明显对称（见图1和图2）。自称奇痒难忍。我第一感觉是胳膊感染了。我询问他有没有接触什么特别的东西，他说一周前有抱过朋友家的病猫。当时他自己也没有感染方面的意识，一周后胳膊就出现了症状。

根据感染部位和接触史，我大概的判断这很可能是浅部真菌——皮肤癣菌感染。但对于浅部真菌培养及鉴定，本实验室至今还是空白。而且我个人真菌学知识欠缺、经验缺乏，对于如何取材以及能准确的捕捉到病原体，这都是一种挑战。本来是想推荐该同学到能做真菌检测的宝鸡市中心医院皮肤科去就诊，但转眼一想还是涂个片看看，再做决定。

皮屑，甲屑这些标本的培养本来我们实验室是没有条件的。标本采集的工具和材料我们实验室都不齐全，无奈我跑到手术室去借了一次性的手术刀。在做好自身防护的条件下，先用75%的酒精给同学清洁病灶，以减少细菌污染的机会。等酒精干后，用无菌手术刀刮取病灶边缘的皮损部的皮屑，置于无菌培养皿中等待培养，然后再刮取少量于滴加1~2滴无菌生理盐水的玻片上，等干燥后固定革兰染色镜检。镜检结果如下（见图3和图4）。

培养时因本室没有PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)和28℃培养箱，所以接种了血平板和SDA(沙氏葡萄糖琼脂)放置于35℃培养箱培养。本菌在35℃生长缓慢，72h菌落如下（见图5-7）。因本菌在血平板生长不良，后续丢弃。

  72h棉蓝染色镜检结果如下（见图8）。此时菌落特点也不典型，没有产生任何色素、棉蓝染色镜下形态学也无从判断究竟是何真菌感染。浅部真菌，与猫有接触史，经过查资料，高度考虑犬小孢子菌的可能。但棉兰镜下与微生物图谱对照大相径庭，难道不是犬小孢子菌？继续观察，还是让菌落生长的更为典型再说。

图8（棉蓝染色，X400）

35℃培养SDA平板6天和8天的菌落正反面（见图9-11）。

有了菌落特点的进一步典型，表面颜色从白色到黄色，犬小孢子菌的感染的可能性更大。但棉蓝染色镜下特点依然让我一头雾水，究竟是不是犬小孢子菌的感染？经请示科主任同意，我们在严格执行生物安全的情况下，把标本送到了宝鸡市第三人民医院上质谱（MALDI-TOF MS）鉴定。结果证实为犬小孢子菌，得分达到了9.3分以上。质谱（MALDI-TOF MS）峰图如下（见图12）。

图12 质谱（MALDI-TOF MS）峰图 

鉴定结果出来以后，对自己的不解，我咨询了真菌界专家厦门大学附属第一医院徐和平老师。原来犬小孢子菌在SDA上初代培养时极少产孢或不产孢，必须传代到PDA或米饭培养基上才可产孢。我借遍了宝鸡市所有二三甲医院，没有一家医院有用PDA平板。只好做米饭培养基。经徐和平老师的耐心指导，我买来了饭盒，普通大米，米:水=1:1比例，米饭高压，121℃高压15min。将菌点种在米饭培养基上，放室温进行培养。

好奇心促使我每天都要看一下菌菌的长势。连续3天没长出任何东西！我失落之余更是灰心，肯定是某个环节没做好，实验失败了。接下来2天没有勇气去看，第5天的时候，继续观察，奇迹般的长了，那种喜悦之情无疑跟中了彩票一样。随后粘菌进行棉蓝染色，会看到分生孢子吗？心里充满了无限期待。结果如下（图13-15）：

图13犬小孢子菌，室温培养9d,米饭培养基 

图14犬小孢子菌，室温培养5d,乳酸酚棉蓝染色，X400

图15犬小孢子菌，室温培养7d,SDA

此时心中敞亮，谈几点自己对本菌的体会吧！

1、首先，本菌属于浅部真菌，只要涉及操作对于其生物安全的防护是永远要放第一位的。真菌标本具有潜在的感染性，真菌孢子容易悬浮于空气中，造成实验室的污染和工作人员的感染，必须采取有效的防护措施，隔离衣、口罩、帽子、手套、鞋套、护目镜等配备必须齐全。如若工作人员能力不足及实验室硬件条件欠缺，不建议开展真菌的检测。比如真菌实验室必须与其别的微生物学实验室区别开来，不能混用。要有单独的生物安全柜，单独的28培养箱，不能与其他一般细菌培养箱混用，以免造成交叉污染。实验室环境要注意消毒，多开窗通风使空气对流，对生物安全柜也要及时消毒并用75%酒精擦拭内壁及台面。对于生长真菌的平板必须用透明胶带密封然后高压处理再按普通医疗垃圾处理。

2、浅部真菌标本的采集处理时，应当具备常用的检查工具。如光学显微镜、酒精灯、连柄手术刀、镊子、剪刀、透明胶带、载玻片等。皮屑、甲屑等也可用10%的KOH处理，使其角质层细胞变成透明，使真菌菌丝或孢子易于观察。培养时，在SDA和PDA上生长快速，接种2-3天后开始生长，扁平，绒毛状，表面从白色到浅黄色，背面黄色。但在SDA上不产生大分生孢子和/或小分生孢子，传代到PDA或米饭培养基上可促进大小分生孢子的产生，大分生孢子数量多，呈梭形、纺锤形，有4-12个分隔。有粗糙厚壁。

3、另外，皮肤感染的丝状真菌主要包括毛癣菌属、小孢子菌属和表皮癣菌属。它们不是正常皮肤菌群的组成部分。它们主要通过寄生在皮肤、毛囊和指甲的浅层引起疾病，很少引起严重感染，是人类引起真菌感染的最常见原因。在世界各地都有分布。犬小孢子菌的种群宿主是猫科动物，人经常被猫科携带者感染，但是确很少发生直接的人与人之间的传播，这使得人仅仅是一个临时宿主。本菌的典型的环状病变是病原体在角质层中以离心方式向外生长的结果，男性感染比女性感染更为常见，主要通过临床表现诊断。如果诊断有疑问，用手术刀刮取病灶边缘的皮肤鳞屑，镜检找菌丝的存在，如果临床治疗没有反应，可以进行培养。治疗主要以局部治疗为主。本病例说明，及早诊断，尤其是病原学诊断，及早治疗，就可以避免更广泛的疾病发展。

4、治疗文献见热病和最新综述。该菌散发为主，也有暴发，值得关注。

5、通过对本病例的认识，我深刻体会到理论和实践相结合对一个菌种的认识是多么深刻，也深感自己微生物学知识的浅薄，尤其是真菌形态学的提高还有好长的路要走。虔诚地向书本学习，真诚地向各位老师请教，努力提高自己的真菌检测水平，为临床提供更好的辅助诊断，服务好每一位患者。

致谢：特别感谢徐和平教授！