作者｜靳龙阳 北京大学人民医院

近些年来，碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌(CRKP)分离率不断增长，极大限制了临床治疗选择。CRKP获得外源性pLVPK-like毒力质粒后，可形成碳青霉烯耐药的高毒力肺炎克雷伯菌(CR-hvKP)，可同时表现出多重耐药性和高毒力表型，严重威胁人类健康。中性粒细胞是抵御和清除病原微生物的重要防御机制，可以通过分泌抗菌肽、表达细胞因子、发挥吞噬作用、形成胞外捕获网(NETs)等抗菌机制杀灭并清除病原体。中性粒细胞胞外捕获网是一种来源于中性粒细胞的DNA网状结构，能够以非共价形式结合多种抗菌成分，捕获和杀灭多种病原微生物，在宿主免疫中发挥重要作用。

II型糖尿病是以胰岛素抵抗和慢性炎症状态为特征的代谢性疾病，糖尿病患者血清中可检测到高水平的DNA-MPO复合物，皮肤伤口组织中也可观察到NETs形成增加，提示II型糖尿病患者的中性粒细胞更易形成NETs。作为中性粒细胞重要的胞外抗菌机制，NETs形成的增加与糖尿病患者对肺炎克雷伯菌感染的敏感性相矛盾。本研究利用临床分离的CR-hvKP菌株C2166，比较糖尿病患者NETs与正常NETs的杀菌能力差异，以探究糖尿病患者对肺炎克雷伯菌易感性的可能分子机制。

应用相同剂量和条件的PMA或A23187，诱导健康人和糖尿病患者中性粒细胞形成NETs，免疫荧光染色实验发现糖尿病组形成NETs结构的中性粒细胞比例明显高于健康对照组（图1a, 1b）。同时，糖尿病患者血清中MPO-DNA复合物的水平也高于健康对照组（图1c）。

图1 a-c

为比较糖尿病组和健康对照组中性粒细胞的吞噬能力差异，本研究通过流式细胞术检测吞噬C2166菌株的中性粒细胞的比例， ATCC 25922 E. coli菌株作为对照菌株。实验结果显示糖尿病组和健康对照组的中性粒细胞都可以有效的吞噬E. coli菌株（吞噬率>90%），而对C2166菌株的吞噬率较低（<5%），这与CR-hvKP的抗吞噬特征相一致（图1d, 1e）。

图1 d-e

NETs杀菌实验发现，糖尿病组形成的NETs对CR-hvKP菌株C2166的杀菌能力下降，C2166菌株的存活率更高。DNase I破坏NETs后，糖尿病组和健康对照组形成的NETs都无法杀伤C2166，提示NETs的杀菌能力缺陷可能是糖尿病患者NETs增多而对肺炎克雷伯菌易感的原因之一。通过扫描电镜观察细菌表面形态发现，健康对照组NETs可造成CR-hvKP菌株表面形成明显的形态破坏，而糖尿病组NETs中的CR-hvKP表面较为平滑，形态正常。

图2 a-d

该项研究证实，糖尿病患者中性粒细胞吞噬能力与健康对照组相似，尽管更高比例的中性粒细胞可以形成NETs，但对CR-hvKP菌株的杀伤能力下降，这种杀伤能力的下降可能与NETs对细菌表面破坏能力的下降有关。

该项研究于2020年8月29日在线发表于Virulence杂志。