2021-04-08 21:59
作者 郭丽 等
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摘 要
近日，由中国医学科学院病原生物学研究所联合中日友好医院、武汉市金银潭医院、首都医科大学附属地坛医院和哈尔滨医科大学附属第二医院等多家单位在传染病权威期刊《新发微生物与感染》杂志（Emerging Microbes & Infections）在线发表题为《人冠状病毒OC43刺突蛋白交叉反应抗体与COVID-19患者疾病严重程度相关:一项回顾性研究》（Cross-reactive antibody against human coronavirus OC43 spike protein correlates with disease severity in COVID-19 patients: a retrospective study》研究成果。中国医学科学院病原生物学研究所王健伟教授和中日友好医院曹彬教授为共同通讯作者；郭丽、王业明、康亮、胡永峰、王凌航、钟景川、陈宏为共同第一作者。
体液免疫反应在清除病毒感染和形成有助于防止病毒再感染的记忆反应中起核心作用。季节性人冠状病毒（HCoVs）包括HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HCoV-HKU1，在全球范围内广泛传播。这些病毒通常引起自限性的普通感冒，大多数症状都很轻微。由于随着年龄的增长可发生反复感染，针对季节性HCoVs的抗体在人类中普遍存在，其在成年人中的血清流行率可达90%以上，远高于儿童。新发感染与宿主免疫之间的相互作用非常复杂，宿主免疫应答在病毒性疾病中的作用已引起人们的关注。例如，研究表明，在2009年甲型H1N1流感患者中，既有的抗季节性流感抗体是严重疾病和不良预后的危险因素。在没有病毒暴露史的的受试者体内针对新冠病毒的T细胞反应，提示人体内可能存在季节性HCoVs和新冠病毒间可能存在交叉反应性细胞免疫。季节性HCoVs感染与与新冠病毒之间是否存在交叉反应性体液免疫反应，其在新冠肺炎中发挥何种作用尚不清楚。
针对上述问题，作者收集了344例COVID-19患者的838份血浆样本，分析了 SARS-CoV-2和季节性HCoVs抗S蛋白IgG抗体（S-IgG）的动态变化，检测了 SARS-CoV-2和季节性HCoV之间S蛋白的抗原交叉反应，进一步评估了HCoV-OC43 S-IgG抗体水平与COVID-19患者严重程度的相关性。研究结果发现，交叉反应性HCoV-OC43 S-IgG抗体水平与COVID-19患者的疾病严重程度相关。
文章链接：
https://doi.org/10.1080/22221751.2021.1905488
一、样本的临床特征及选择
此项研究共收集了4个队列344例COVID-19患者的838份血浆样本，涵盖120例轻/中症患者的194份血浆样本，224例重症/危重症患者（包括49例死亡病例）的644份血浆样本（每个队列的受试者人口学特征和血浆样本数量如表S1和S2所示）
所有来自于COVID-19患者和健康个体的血浆样本均在在56°C灭活30min，进行酶联免疫吸附（ELISA）、间接免疫荧光（IFA）、免疫印迹（Western-blot）和微量中和试验（MN）分析。
表S1. 本研究中招募的4个队列COVID-19患者的参与者人口学统计信息
表S2. 本研究中4个队列的血浆样本数量
二、季节性HCoVs和SARS-CoV-2 S-IgG 抗体ELISA检测方法的建立
本研究建立了季节性冠状病毒HCoVs和SARS-CoV-2 S-IgG的ELISA检测方法，并将其用于季节性HCoVs （HCoV-NL63、HCoV-229E、HCoV-OC43和HCoV-HKU1） S-IgG抗体检测和SARS-CoV-2 S-IgG抗体检测。采用棋盘格滴定法测定最佳抗原包被浓度和最佳血浆稀释度分别为20 ng/孔和1:400，确定了SARS-CoV-2、HCoV-NL63、HCoV-229E、HCoV-OC43和HCoV-HKU1 ELISA检测的S-IgG阈值分别为0.21、0.20、0.20、0.20和0.20。
三、COVID-19患者HCoV-OC43 S-IgG和SARS-CoV-2 S-IgG抗体具有相似的动态变化模式
作者发现SARS- CoV-2 S-IgG在症状出现后第2天即可以检出，抗体滴度于症状出现后22-28天达到峰值。同时对患者血浆HCoV-OC43 S-IgG抗体的分析也发现相似的趋势，但是另外三种季节性冠状病毒HCoV-NL63、−229E和-HKU1 S-IgG抗体滴度未发现明显的滴度变化。（如图1所示）
图1. SARS-CoV-2和HCoV-OC43 S-IgG抗体的时间动态变化。(A-B)用ELISA法检测COVID-19患者血浆样本SARS-CoV-2 S-IgG (A)和HCoV-OC43 S-IgG (B)水平随症状后时间的动态变化。(C) COVID-19患者血浆标本HCoV-OC43 S-IgG和SARS-CoV-2 S-IgG水平的相关性。(D-E)有连续2-5次样本的COVID-19患者血浆HCoV-OC43 S-IgG水平的变化动力学。
四、SARS-CoV-2与HCoV-OC43S蛋白存在双向交叉反应
为了探讨抗HCoV-OC43-S蛋白抗体滴度的增加是否来自于HCoV-OC43与SARS-CoV-2的交叉反应，作者进行了竞争性ELISA、Western blot以及IFA分析。结果均显示：SARS-CoV-2和HCoV-OC43的S蛋白具有双向交叉反应性，说明SARS-CoV-2和HCoV-OC43之间的S蛋白存在交叉反应的表位，且这种交叉反应主要由S蛋白的S2亚基介导。（如图2所示）
图2. SARS-CoV-2与HCoV-OC43的双向抗原交叉反应。(A) 分别由0.5%牛血清白蛋白(BSA)或SARS-CoV-2 S蛋白竞争反应后，50例COVID-19患者血浆中HCoV-OC43 S-IgG水平。(B) 分别使用0.5% BSA或HCoV-OC43 S蛋白竞争反应后，50例COVID-19患者血浆样本中SARS-CoV-2 S- IgG水平。(C) Western blot分析SARS-CoV-2和HCoV-OC43 S蛋白的交叉反应性。
五、血浆HCoV-OC43 S-IgG与SARS-CoV-2无交叉中和反应
由于S蛋白是诱导中和抗体的主要免疫原，因此作者利用HCoV-OC43 阳性血浆和SARS-CoV-2进行了微量中和试验，同时利用COVID-19患者血浆作为阳性对照，以确定HCoV-OC43 S蛋白是否能诱导产生对SARS-CoV-2具有功能性中和作用的抗体。结果表明，HCoV-OC43阳性血浆与SARS-CoV-2之间无交叉中和作用。（如图3所示）
图3. SARS-CoV-2与HCoV-OC43 S-IgG的交叉反应。(A-B)间接免疫荧光法（A）和免疫印迹法(B)检测HCoV-OC43 S-IgG与SARS-CoV-2的交叉反应性。(C) SARS-CoV-2与HCoV-OC43 S-IgG的交叉中和反应性。
六、较高的HCoV-OC43抗体滴度与疾病严重程度相关
然后作者探索COVID-19患者的交叉反应抗体与疾病严重程度之间的关系。ELISA分析结果表明，发病10天内，较高的交叉反应性HCoV-OC43 S-IgG抗体滴度与COVID-19患者病情严重程度相关，交叉反应性HCoV-OC43抗体水平可能是影响COVID-19患者临床结局的一个危险因素。（如图4所示）
图4. HCoV-OC43交叉反应性抗体与COVID-19患者的疾病严重程度相关。(A)轻、重型COVID-19患者SARS-CoV-2 S-IgG水平动态变化。(B)不同年龄组COVID-19患者症状出现后HCoV-OC43 S-IgG水平随症状出现后不同时间的变化。(C)不同年龄组HCoV-OC43 S-IgG滴度与疾病严重程度(轻、重)的相关性。(D) 60-85岁患者在症状出现后1-10天HCoV-OC43 S-IgG滴度与临床结局(存活和非存活)的相关性。(E)不同年龄组HCoV-OC43 N-IgG滴度与疾病严重程度(轻度和重度)的相关性。(F) 60-85岁患者症状出现后1-10天HCoV-OC43 N-IgG滴度与临床结局(存活和非存活)的相关性。
为进一步阐明HCoV-OC43 S-IgG交叉反应性抗体在COVID-19患者致病中的作用，作者对790例COVID-19患者血浆进行了HCoV-OC43 S-IgG竞争ELISA分析，以排除SARS-COV-2抗体的干扰。结果显示：采用竞争ELISA后，在症状出现后第1-21天，重症患者HCoV-OC43 S-IgG仍高于轻症患者。需要机械通气的患者HCoV-OC43 S-IgG滴度高于不需要机械通气的患者。在60岁以上COVID-19患者中，发病1-10天时HCoV-OC43 S-IgG抗体滴度与疾病严重程度呈正相关（如图5所示）。这些结果排除了交叉反应性HCoV-OC43 S-IgG抗体滴度与疾病严重程度的相关性不仅仅是由于SARS-CoV-2 S-IgG抗体导致的。
此外，与轻/中症患者相比，重症患者的血浆IL-1β、IL-5、IL-7、IL-8、MIP-1β、RANTES和TNFα的浓度更高。HCoV-OC43 S-IgG滴度与血浆中IL-1β、IL-5、IL-7、IL- 8、MIP -1β、RANTES、TNFα等细胞因子及趋化因子浓度呈正相关，表明COVID-19患者高水平的HCoV-OC43 S-IgG滴度与系统炎症反应有关。
图5. SARS-CoV-2蛋白竞争后COVID-19患者血浆HCoV-OC43抗体滴度与疾病严重程度的相关性 (A)、 分别用0.5%牛血清白蛋白(BSA)或SARS-CoV-2 S蛋白预处理的COVID-19患者血浆标本中HCoV-OC43 S- IgG抗体水平。(B-C)使用SARS-CoV-2 S蛋白竞争后检测轻度和重度症状患者 (B)、机械通气和非机械通气患者(C)的HCoV-OC43 S-IgG水平。(D-F) 使用SARS-CoV-2 S蛋白竞争后检测60-85岁患者出现症状后1-10天HCoV-OC43 S-IgG滴度与疾病严重程度(轻度和重度) (D)、机械通气和非机械通气 (E)、存活和非存活 (F) 的相关性。
SARS-CoV-2和HCoV-OC43 S蛋白之间存在双向抗原交叉反应。交叉反应性HCoV-OC43 S-IgG不能中和SARS-CoV-2，但其水平与COVID-19患者的疾病严重程度相关，即重症患者HCoV-OC43 S-IgG高于轻症患者，需要机械通气的患者HCoV-OC43 S-IgG滴度高于不需要机械通气的患者。在60岁以上COVID-19患者中，发病1-10天时HCoV-OC43 S-IgG抗体滴度与疾病严重程度呈正相关。这些发现有助于我们理解SARS-CoV-2感染过程中的病理过程，以及可能影响预后的因素。
郭 丽
中国医学科学院病原生物学研究所研究员，博士生导师，主要从事呼吸道病毒病原学和免疫学研究。主持承担和参与“863计划”、“重大传染病防治科技重大专项”和“国家自然科学基金”等多项国家级科研项目。作为第一作者和通讯作者在《Lancet》、《Nat Commun》、《Clin Infect Dis》、《Emerg Infect Dis》等SCI收录杂志上发表学术论文20余篇。
王业明
博士。中日友好医院呼吸与危重症医学科医师。主要研究方向为流感及其他呼吸道病毒感染性疾病。在多个SCI杂志发表多篇论文。作为课题骨干参与科技部重点研发、传染病重大专项以及H7N9应急专项等多项课题。
康 亮
武汉市金银潭医院ICU主治医师，擅长重症肺炎的呼吸治疗、ECMO支持等。是ECMO小组成员。新冠肺炎期间在医务处负责医疗救治的协调工作，2月中旬到ICU病区，直到完成病区重症患者清零。
胡永峰
中国医学科学院病原生物学研究所卫生健康委病原系统生物学重点实验室研究员，主要从事新发、突发传染病的应急防控体系建设及研究工作。
王凌航
首都医科大学附属北京地坛医院主任医师，感染病急诊主任，首都医科大学传染病研究所副所长。英国牛津大学临床免疫学博士，首都医科大学教授，硕士生导师。北京预防医学会感染病专委会青委会主任委员；北京医学会感染病学分会青委会副主任委员；中国医院协会传染病医院管理分会艾滋病综合管理专业学组副组长，全国卫生检疫标准化技术委员会委员；中华医学会公共卫生分会第十届委员会青年委员会副主任委员；中华预防医学会旅行卫生分会第四届委员会委员。
钟景川
中国医学科学院病原生物学研究所科研助理，主要从事呼吸道病毒病原学和免疫学研究工作。
陈 宏
哈尔滨医科大学附属第二医院呼吸与危重症医学科主任，主任医师，教授，博士生导师；中华医学会呼吸病分会间质病学组委员；中国医师协会呼吸病分会常务委员；中华预防医学会呼吸病预防与控制专委会全国委员；国家呼吸内科专业质控中心专家委员会全国委员；中国康复医学会呼吸康复专业委员会副主任委员；中国残疾人协会肺康复委员会常委；中国戒烟联盟理事；黑龙江省医学会呼吸病分会副主任委员；肿瘤靶向治疗分会副主任委员；中国肺癌防治联盟黑龙江省分联盟哈医大二院肺结节诊治中心副主任委员；哈尔滨市医学会呼吸病分会副主任委员。
END
作者｜郭丽 中国医学科学院病原生物学研究所
作者｜王业明 中日友好医院呼吸与危重症医学科
作者｜康亮 武汉市金银潭医院
作者｜胡永峰 中国医学科学院病原生物学研究所
作者｜王凌航 首都医科大学附属北京地坛医院
作者｜钟景川 中国医学科学院病原生物学研究所
作者｜陈宏 哈尔滨医科大学附属第二医院
审校｜陈宏斌、余方友
